Sterilisasi Tunas Jabon untuk Mendapatkan Eksplan Steril secara in Vitro.

BAB I
PENDAHULUAN
1.1

Latar Belakang
Jabon (Anthocepalus cadamba (Roxb.) Miq.) merupakan salah satu fast

growing spesies. Tanaman jabon mempunyai banyak manfaat, yaitu: (1) Semua
bagian dari tanaman jabon mulai dari akar, batang, buah, bunga, dan daun
mengandung zat-zat yang dapat dimanfaatkan dalam bidang farmasi (Dubey et al.
2011); (2) Kayu jabon digunakan dalam industri perkayuan untuk veneer, kayu
lapis, papan lamina, industri kertas (pulp and paper), kayu pertukangan, dan
meubel (Nugroho 2011); (3) Pohon jabon juga dapat berfungsi sebagai peneduh
dan pelindung tanaman; (4) Digunakan dalam program reboisasi dan penghijauan,
rehabilitasi lahan pasca tambang dan (5) Dapat memperbaiki sifat-sifat fisika dan
kimia tanah di bawah tegakan (Orwa et al. 2009). Selain itu jabon mempunyai
keunggulan sifat fisik, yaitu kemampuan beradaptasi pada berbagai tempat
tumbuh tinggi, bebas dari hama dan penyakit serius, dan perlakuan silvikultur
mudah (Krisnawati et al. 2011). Dengan berbagai manfaat dan keunggulan
tersebut, membuat jabon digunakan sebagai tanaman jenis baru pada Hutan
Tanaman Industri (HTI), hutan rakyat, maupun sebagai tanaman pionir pada
rehabilitasi lahan bekas tambang. Hal ini membuat permintaan pasar dari tanaman
jabon meningkat.
Pemenuhan permintaan pasar dari bibit jabon sampai saat ini dilakukan
melalui perbanyakan generatif dengan benih. Meskipun benih jabon melimpah,
dan perbanyakan vegetatif konvensionalnya tidak sulit, perlu teknik budidaya
yang lebih efektif, efisien dan mampu menghasilkan bibit yang unggul, dan
seragam dalam skala besar yaitu melalui kultur jaringan.
Kultur jaringan merupakan metode perbanyakan vegetatif yang dapat
menghasilkan bibit dalam jumlah banyak, seragam, dan sama dengan induknya
secara kontinyu dalam waktu dan tempat yang lebih efisien. Banyak permasalahan
yang dihadapi dalam kultur jaringan, seperti kontaminasi dan browning.
Keberhasilan dalam perbanyakan melalui kultur jaringan ini ditentukan oleh
teknik sterilisasi eksplan yang tepat. Kegiatan sterilisasi yang tidak sempurna
dapat menimbulkan adanya kontaminasi yang merupakan permasalahan utama

2

dalam kultur jaringan. Residu dari kegiatan sterilisasi yang tidak sempurna juga
dapat mengakibatkan matinya jaringan eksplan yang akan mengakibatkan matinya
eksplan. Kandungan fenol dari tanaman berkayu dapat teroksidasi yang akan
mengakibatkan browning pada eksplan. Kontaminasi dan browning ini dapat
mengganggu jalannya kegiatan kultur jaringan serta menurunkan produksi bibit.
Prinsip dari proses sterilisasi eksplan adalah semaksimal mungkin menghilangkan
mikroorganisme kontaminan yang tidak diinginkan dengan gangguan sekecil
mungkin pada jaringan eksplan. Oleh karena itu, perlu adanya metode sterilisasi
jabon yang tepat dalam perbanyakannya secara in vitro.
1.2

Tujuan
Tujuan dari penelitian ini ialah:

1. Menetapkan metode sterilisasi yang tepat untuk memperoleh eksplan jabon
(Anthocepalus cadamba (Roxb.) Miq.) yang steril secara in vitro.
2. Menghasilkan eksplan jabon (Anthocepalus cadamba (Roxb.) Miq.) yang
steril dan siap dimultiplikasi.

3

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1

Jabon (Anthocepalus cadamba (Roxb.) Miq.)
Jabon (A. cadamba Roxb. Miq.) merupakan jenis pohon cepat tumbuh

yang masuk dalam famili Rubiaceae dan genus Anthocepalus. A. cadamba Roxb.
Miq. ini bersinonim dengan A. chinensis (Lamk) A Rich, A. macrophyllus (Roxb.)
Havil, A. indicus A. Rich., A. morindaefolius Korth, Nauclea cadamba (Roxb.),
Neolamarkcia cadamba (Roxb) Bosser, Sarcocephalus cadamba (Roxb) Kurz.
Jabon memiliki nama daerah galupai, johan, kalampain, kelempi (Sumatera);
jabon, jabun, hanja, kalampeyan, kelampaian (Jawa);

jabon, jabun, haja,

kelampeyan (Kalimantan); pontua, suge manai, pekaung, toa (Sulawesi);
gumpayan, kelapan, mugawe (Nusa Tenggara); paribe, masarambi (Irian Jaya) (
Mansur et al. 2010).
Jabon adalah pohon berukuran besar dengan batang lurus dan silindris
serta memiliki tajuk yang tinggi seperti payung dengan sistem percabangan yang
khas mendatar. Kulit batang pada waktu muda berwarna abu-abu tanpa alur,
sedangkan kulit pohon tua kasar dan sedikit beralur (Krisnawati et al. 2011).
Daun jabon merupakan daun tunggal, bertangkai panjang 1,5−4 cm dengan
helaian daun agak besar (panjang 15−30 cm dan lebar 7−8 cm). Di awal
pertumbuhannya, yakni 2−3 bulan setelah tanam, pada tanah yang subur dan
cukup air, daun jabon dapat berkembang hingga berukuran panjang 68 cm dan
lebar 38 cm (Mansur et al. 2010). Umumnya, jabon mulai berbunga pada umur
4−5 tahun. Buah jabon berupa buah majemuk yang berbentuk bulat dan lunak.
Bagian atas bakal buah beruang yang terdiri atas jutaan biji berukuran sangat
kecil, dari 1 kilogram buah jabon rata-rata dihasilkan 18−26 butir biji (Mulyana
2011).
Jabon merupakan tanaman pionir yang dapat tumbuh dengan baik pada
tanah-tanah alluvial yang lembab, pinggir sungai, peralihan rawa dan tanah
kering, kadang tergenang air. Jenis ini juga tumbuh baik pada berbagai jenis
tanah, yaitu liat, lempung podsolik coklat, dan tanah-tanah yang subur dan
beraerasi baik. Jabon toleran terhadap tanah masam, tetapi pertumbuhannya

4

menjadi kurang optimal apabila ditanam pada lahan berdrainase jelek (Mansur et
al. 2010).
Cahaya merupakan faktor yang sangat penting bagi pertumbuhan jabon.
Suhu maksimum yang dapat ditoleransi jabon adalah 32º−42ºC dan suhu
minimum berkisar antara 3−15,5ºC. Rata-rata curah hujan di habitat alaminya
adalah 1500−5000 mm per tahun (Krisnawati et al. 2011). Ketinggian yang dapat
ditoleransi jabon yaitu pada kisaran 0−1000 m dpl. Ketinggian optimal untuk
mencapai produktivitas maksimumnya ialah kurang dari 500 m dpl (Mansur et al.
2010).
Penelitian di India menyebutkan bahwa semua bagian dari tanaman jabon
berfungsi dalam bidang farmasi. Kulit batang jabon mengandung zat analgesik,
antipiretik, antiradang (Mondal et al. 2009), antidiabetes (Bussa et al. 2010),
antimikroba (Chandel et al. 2011), antioksidan, penawar racun (Hossain et al.
2011), penenang, dan penurun tekanan darah (Gurjar et al. 2010). Daun jabon
mengandung zat antimikroba (Chandrashekar et al. 2009) dan penurun tekanan
darah (Ahmed et al. 2011). Bunga jabon mengandung zat antidiare dan penurun
tekanan darah (Alam et al. 2008, 2011). Buah jabon mengandung zat antijamur
dan anti bakteri (Mishra et al. 2011). Akar jabon mengandung antimikroba, anti
cacing dan penurun tekanan darah (Acharrya et al. 2010, 2011).
2.2

Teknik Perbanyakan Kultur Jaringan

2.2.1

Pengertian
Kultur jaringan merupakan suatu teknik budidaya sel, jaringan, ataupun

organ dari suatu tanaman dibawah kondisi aseptik (bebas segala bentuk
mikroorganisme) dan didalam lingkungan yang terkontrol (Evans et al. 2003).
Zulkarnain (2009) mengatakan bahwa kultur jaringan merupakan upaya
mengisolasi bagian-bagian tanaman (protoplas, sel, jaringan, dan organ),
kemudian mengkulturkannya pada nutrisi buatan yang steril dibawah kondisi
lingkungan

terkendali

sehingga

bagian-bagian

tanaman

tersebut

dapat

beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap kembali.
Dasar pengembangan kultur jaringan adalah totipotensi. Totipotensi
merupakan potensi suatu sel untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi
tanaman yang lengkap. Setiap sel akan beregenerasi menjadi tanaman yang

5

lengkap dan utuh apabila ditempatkan pada kondisi yang sesuai (Kumar et al.
2011).
Tahapan kultur jaringan meliputi inisiasi, multiplikasi, perpanjangan dan
induksi akar (pengakaran), dan aklimatisasi. Kegiatan inisiasi meliputi persiapan
eksplan, sterilisasi eksplan hingga mendapatkan eksplan yang bebas dari
mikroorganisme kontaminan. Multiplikasi merupakan tahap perbanyakan eksplan
dengan subkultur (pemindahan eksplan dalam media baru yang berisi Zat
Pengatur Tumbuh (ZPT)) secara berulang-ulang untuk mempertahankan stok
bahan tanaman (eksplan). Pengakaran merupakan kegiatan terakhir sebelum
planlet

dipindahkan

ke

kondisi

luar.

Aklimatisasi

ialah

proses

pemindahan/pengadaptasian planlet dari kondisi in vitro ke kondisi luar/lapangan
(Kumar et al. 2011).
Kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk mendapatkan tanaman
baru dalam jumlah banyak dan waktu relatif singkat, sifat fisiologi dan morfologi
yang sama dengan induknya, efisien tempat dan waktu, tidak tergantung musim
dan dapat diperbanyak secara kontinyu, dan untuk skala besar biayanya lebih
murah. Menurut Zulkarnain (2009) manfaat dari kultur jaringan di antaranya: (1)
keseragaman genetik (identik dengan induk), (2) kondisi aseptik (bebas patogen),
(3) seleksi tanaman, (4) stok tanaman mikro, (5) lingkungan terkendali, (6)
pelestarian plasma nutfah, (7) produksi tanaman sepanjang tahun, (8)
memperbanyak tanaman yang sulit diperbanyak secara konvensional, dan (9)
perbanyakan klon secara cepat.
2.2.2

Eksplan
Eksplan merupakan potongan tanaman yang diisolasi untuk inisiasi kultur

jaringan. Respon masing-masing eksplan dalam kultur jaringan akan berbeda.
Kemampuan regenerasi eksplan dalam kultur jaringan sangat dipengaruhi oleh
tipe eksplan, varietas eksplan, umur tanaman induk sumber eksplan, konsisi
fisiologis, dan ukuran eksplan.
Tipe eksplan merupakan faktor yang penting dalam mengoptimalkan
pelaksanaan kultur jaringan (Kumar et al. 2011). Tipe eksplan seperti tunas
pucuk, tunas ketiak (aksilar), akar, mata tunas, daun, embrio, dan bakal biji akan
memberikan perbedaan yang signifikan pada pertumbuhan eksplan (Jabeen et al.

6

2005, Chaudhry et al. 2010). Hal ini dikarenakan adanya perbedaan kandungan
hormon pada masing-masing bagian eksplan (Kumar et al. 2011). Varietas
eksplan juga merupakan faktor yang penting dalam mempengaruhi regenerasi
eksplan (Kamal et al. 2007, Michel et al. 2008).
Peluang keberhasilan kultur jaringan dipengaruhi juga oleh umur tanaman.
Semakin muda tanaman, maka akan semakin besar keberhasilan dalam kultur
jaringan. Jaringan muda (juvenile) memiliki sel-sel yang aktif membelah dengan
kecepatan pembelahan sel yang tinggi sehingga jaringan muda merupakan bahan
eksplan yang baik. Naughmouchi et al. (2008) mengatakan respon eksplan akan
menurun seiring pertambahan umur eksplan.
Kondisi fisiologi eksplan berperan penting dalam keberhasilan teknik
kultur jaringan. Pada umumnya bagian vegetatif lebih siap beregenerasi daripada
bagian generatif. Kondisi fisiologis dari suatu tanaman bervariasi secara alami,
sejalan dengan pertumbuhan tanaman yang dipengaruhi oleh lingkungannya.
Pengaturan lingkungan tanaman yang bersih dan higienis, dengan pengubahan
status fisiologi tanaman induk seperti memanipulasi cahaya, suhu, suplai air,
suplai hara dan zat pengatur tumbuh akan mempengaruhi fisiologi eksplan
(Zulkarnain 2009).
Ukuran eksplan menentukan laju kehidupan bahan eksplan. Eksplan yang
berukuran kecil, lebih mudah disterilisasi sehingga akan memperkecil peluang
kontaminasi baik secara internal maupun eksternal, namun kemampuan
beregenerasi

juga

kecil

sehingga

diperlukan

media

kompleks

dalam

pertumbuhannya. Semakin besar ukuran eksplan maka akan semakin besar
kemampuan beregenerasi, namun peluang untuk kontaminasi juga semakin besar
(Zulkarnain 2009).
2.2.3

Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
Zat Pengatur Tumbuh merupakan senyawa organik dalam konsentrasi

rendah

yang

dapat

merangsang,

menghambat,

atau

secara

kualitatif

mempengaruhi pertumbuhan tanaman. Contoh ZPT ialah sitokinin dan Giberelin.
Sitokinin adalah senyawa yang dapat meningkatkan pembelahan sel pada
jaringan tanaman serta mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman.
Sitokinin mengatur pembelahan sel, pemanjangan sel, diferensiasi sel, dan

7

pembentukan organ tanaman. Sitokinin yang paling banyak digunakan dalam
kultur jaringan tanaman adalah kinetin, benzil adenin (BA), benzil amino purin
(BAP), dan zeatin (Zulkarnain 2009). Beyl (2000) mengatakan bahwa pada
konsentrasi tinggi sitokinin dapat menginduksi perbanyakan tunas, tetapi
menghambat pembentukan akar.
Giberelin (GA3) terdiri atas kira-kira 60 macam senyawa, giberelin
merupakan ZPT yang paling banyak ditemukan dalam tanaman (Zulkarnain
2009). Menurut Evans et al. (2003) fungsi utama dari giberelin pada tanaman
yaitu menstimulasi pemanjangan ruas batang dan pembungaan. Giberelin juga
ditemukan pada cadangan makanan dari endosperma pada tahap pertumbuhan
embrio dan perkecambahan. Beyl (2000) mengatakan, giberelin berfungsi untuk
merangsang pertumbuhan ruas dan dibutuhkan untuk pertumbuhan meristem.
Menurut Zulkarnain (2009) biasanya giberelin digunakan dalam medium kultur
untuk meningkatkan pemanjangan pucuk-pucuk yang sangat kecil dan
merangsang pembentukan embrio dari kalus.
2.2.4

Sterilisasi Eksplan
Proses sterilisasi merupakan kegiatan mengeliminasi dan mematikan

mikroorganisme sampai ke tingkat yang tidak memungkinkan lagi berkembang
biak dan menjadi sumber kontaminan. Eksplan yang didapat tidak dari perlakuan
steril, misalnya dari rumah kaca, sangat besar kemungkinannya terkontaminasi
debu dan mikroorganisme.
Proses sterilisasi yang tidak sempurna akan menimbulkan adanya
kontaminasi. Kontaminasi yang umum terjadi adalah kontaminasi oleh cendawan
dan bakteri. Komposisi medium kultur jaringan yang mengandung gula, vitamin,
asam asam amino, garam-garam anorganik, air, zat pengatur tumbuh, dan bahan
pemadat sangat menguntungkan untuk pertumbuhan cendawan dan bakteri. Bila
diberi kesempatan maka organisme tersebut akan tumbuh dengan cepat, dan
dalam waktu singkat akan menutupi permukaan medium dan eksplan yang
ditanam. Selanjutnya organisme ini menyerang eksplan melalui bekas luka
pemotongan pada saat perlakuan sterilisasi. Beberapa jenis mikroorganisme
melepaskan senyawa beracun ke dalam medium kultur yang dapat menyebabkan
kematian eksplan (Zulkarnain 2009).

8

Beberapa sumber kontaminasi mikroorganisme pada sistem kultur
jaringan, adalah: (1) media, (2) lingkungan kerja yang kurang steril dan pelaksana
penanaman yang kurang hati-hati dan kurang teliti, (3) eksplan, secara internal
(kontaminan terbawa di dalam jaringan tanaman), (4) eksplan, secara eksternal
(kontaminan berada di permukaan eksplan akibat prosedur sterilisasi yang kurang
sempurna, (5) serangga atau hewan kecil yang masuk ke botol kultur setelah
diletakkan pada ruang kultur. Dari semua sumber kontaminasi, yang paling sulit
diatasi ialah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, dalam memilih suatu
metode sterilisasi dan bahan sterilisasi (Tabel 1) haruslah selektif, dengan prinsip
semaksimal mungkin menghilangkan mikroorganisme kontaminan yang tidak
diinginkan dengan gangguan sekecil mungkin pada jaringan eksplan (Zulkarnain
2009).
Tabel 1 Bahan sterilisasi yang biasa digunakan dalam sterilisasi permukaan
Bahan Kimia
Sodium hipoklorit
Pemutih komersial
Kalsium hipoklorit
Hidrogen peroksida
Mercuri klorida
Etanol
Benzalkonium klorida

2.2.5

Konsentrasi
0,5-5%
10-20%
9-10%
3-12%
0,1-1%
70-95%
0,01-1%

Medium
Medium merupakan salah satu komponen yang penting dalam metode

kultur jaringan. Kesuksesan aplikasi prosedur kultur jaringan sebagian besar
dipengaruhi oleh medium dengan komposisi yang tepat (Evans et al. 2003).
Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur jaringan yang optimal bervariasi
antar jenis ataupun antar varietas. Bahkan jaringan yang berasal dari bagian
tanaman yang berbeda akan berbeda pula kebutuhan nutrisinya. Meskipun
demikian, medium dasar MS (Murashige and Skoog) merupakan yang paling
banyak digunakan di antara medium yang lain (Zulkarnain 2009). Menurut Evans
et al. (2003) secara umum medium MS mengandung unsur-unsur yang dibutuhkan
tanaman, yaitu air, hara makro, hara mikro, vitamin, dan sumber karbon berupa
glukosa.

9

2.2.6

Antibiotik
Antibiotik merupakan senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme

seperti cendawan dan bakteri yang digunakan untuk membunuh mikrorganisme
lain. Amoksilin merupakan antibiotik yang termasuk pada golongan penisilin
kelas B-Lactams. Amoksilin mempunyai sifat bakteriostatik, yaitu cara kerja
antibakteri dengan menghambat pertumbuhan bakteri. Amoksilin mengganggu
pertumbuhan bakteri dengan cara menghambat sintesis dinding sel bakteri.
Amoksilin merupakan antibakteri dengan spektrum sedang (moderate spectrum),
yang hanya aktif pada beberapa bakteri dan cendawan saja (Joshi 2011).
Antibiotik streptomisin merupakan antibiotik yang

hanya aktif pada

beberapa bakteri saja (narrow spectrum). Streptomisin mempunyai sifat
bakterisidik yaitu bekerja dengan langsung mematikan bakteri dengan cara
menghambat proses sistesis protein dari bakteri. Kloramfenikol mempunyai
spektrum luas (broad spectrum) yang aktif terhadap semua jenis bakteri.
Kroramfenikol mempunyai sifat bakteriostatik yaitu menghambat pertumbuhan
dan perkembangan bakteri dengan cara menghambat sintesa protein (Kaufman
2011).

10

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Pusat

Penelitian Lingkungan Hidup (PPLH) Institut Pertanian Bogor, Laboratorium
Kultur Jaringan Silvikultur, dan rumah kaca Silvikultur, Fakultas Kehutanan,
Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung dari bulan Juni 2011 hingga
April 2012.
3.2

Bahan dan Alat

Bahan bahan yang digunakan meliputi:
a. Bahan tanaman (eksplan)
Bahan tanaman yang dipakai adalah tunas jabon berumur ± 3 bulan (Gambar
1A) yang dibeli dari petani. Bibit jabon kemudian diletakkan di dalam sungkup
yang berada di rumah kaca. Sungkup tersebut ditutup dengan menggunakan
insectnet. Bibit jabon diberikan ZPT (Zat Pengatur Tumbuh) berupa BAP, GA3,
dan pupuk daun dengan cara disemprotkan pada daun setiap hari selama 2
minggu. Peletakan bibit jabon dipisahkan berdasarkan perlakuan karantina, yaitu
tanpa karantina, karantina 7 hari, dan karantina 14 hari. Bibit tanpa karantina
hanya diberikan ZPT, sedangkan bibit yang dikarantina diberi ZPT dan perlakuan
antibiotik berupa steptomisin, amoksilin, dan kloramfenikol setiap hari selama 7
hari dan 14 hari. Tunas tanaman yang diambil mulai dari bagian pucuk sampai
buku kedua (Gambar 1).
b. Bahan media
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS (Murashige dan
Skoog), yang terdiri atas hara makro, hara mikro, larutan vitamin, glukosa, dan
dipadatkan dengan agar-agar tanpa menggunakan ZPT.
c. Bahan sterilisasi
Bahan sterilisasi yang digunakan ialah fungisida (Masalgin); bakterisida
(Agrept 20 WP); antibiotik berupa steptomisin, amoksilin, kloramfenikol; NaOCl,
alkohol 70%, dan betadine.

11

d. Bahann lain
Bahann lain yang digunakan dalam peneelitian ini meliputi
m
dettergen, air steril,
dan air kraan.
Alat alat yang diggunakan daalam penelittian ini ialahh meja kerjja steril (lam
minar
air flow cabinet),
c
auutoklaf, aeraator, timban
ngan dengaan ketelitiann 10-3, hot plate
magnetic stirrer, labbu Erlenmeyer, gelas piala, gelass ukur 10 ml dan 100
0 ml,
cawan Peetri, pipet bulb,
b
pengaaduk, pinsett, spatula, lampu
l
spirttus, sprayerr, pH
meter, plaastik, kuas, karet gelanng, botol ku
ultur, alumuunium foil, corong, gun
nting,
korek api, tissue, oven, masker, jas
j laborato
orium, kameera, tally sheeet, alat tuliis dan
komputer..

Gambaar 1 Bagian tunas
t
jabon yang
y
digunakkan sebagai
eksplann (tanda panaah) pada jaboon berumur
±3 bulaan

3.3

Meetode Kerja
Taahapan-tahappan dalam penelitian ini meliputti sterilisasi alat dan bahan,
b

sterilisasi lingkungann kerja, pem
milihan dan pengambilaan bahan ekksplan, steriilisasi
eksplan deengan bebeerapa perlakkuan, penan
naman ekplaan dalam bootol kultur berisi
media MS
S, serta pem
meliharaan dan pengamaatan eksplann.
Steerilisasi alaat dan bah
han. Akuad
des disterilisasi dengaan menggun
nakan
autoklaf dengan
d
cara mengisikaan air akuad
des tersebut ke dalam bbotol-botol kultur
k

12

dengan isi setengah botol kaca ±100 ml. Botol ditutup dengan plastik dan diikat
dengan karet. Sterilisasi dilakukan pada temperatur 121ºC pada tekanan 1 atm
selama 1 jam. Akuades yang telah disterilisasi diletakkan dalam plastik
transparan, untuk menghindari mikroba masuk ke botol. Alat-alat tanam seperti
pinset, gunting, dan skalpel disterilkan setiap akan dipakai dengan dicelupkan
pada alkohol 70% kemudian dibakar pada lampu spirtus dan selanjutnya
dicelupkan dalam air steril. Alat-alat dari logam yang disterilkan dalam autoklaf
dibungkus dalam kertas tebal. Temperatur yang digunakan dalam sterilisasi alat
ini ialah 121ºC pada tekanan 1 atm selama 20 menit. Cawan Petri dan alat tanam
setelah disterilisasi disimpan dalam oven, dalam keadaan terbungkus kertas
sampai digunakan kembali.
Sterilisasi

lingkungan

kerja.

Sterilisasi

dilakukan

dengan

cara

menyemprot permukaan laminar air flow cabinet (LAFC) dengan menggunakan
alkohol 70% dan menyalakan lampu ultraviolet minimal 30 menit sebelum
digunakan, untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan meja. Pekerja
menyemprot tangannya dengan alkohol, sebelum bekerja menggunakan masker
dan jas laboratorium. Setelah selesai digunakan, permukaan meja disemprot
kembali dengan menggunakan alkohol 70%.
Pemilihan dan pengambilan eksplan. Eksplan diambil pada pagi hari
dari bibit jabon di rumah kaca dengan panjang eksplan sekitar 2−2,5 cm. Eksplan
dipotong dengan menggunakan skalpel yang terlebih dahulu disemprot
menggunakan alkohol 70%. Potongan eksplan dimasukkan ke dalam botol yang
berisikan air steril dan langsung ditutup.
Sterilisasi eksplan. Sterilisasi eksplan dilakukan dengan mengusap satu
persatu eksplan dengan menggunakan alkohol 70% secara perlahan-lahan.
Eksplan

yang

telah

diusap

dengan

alkohol

direndam dengan

larutan

detergen+bakterisida+fungisida masing masing 1 gram dalam 100 ml air steril
selama 30 menit. Selanjutnya, eksplan dibilas dengan menggunakan air kran dan
dibersihkan kembali dengan kuas satu persatu di bawah air mengalir, kemudian
eksplan dibilas dengan air sampai detergen, bakterisida, dan fungisida hilang dari
eksplan. Setelah eksplan bersih, dilanjutkan dengan perendaman memakai aerator
dalam larutan antibiotik (streptomisin+amoksilin+kloramfenikol) masing-masing

13

0,5 mg dalam 100 ml air oksigen selama 1 hari dan 2 hari. Eksplan tanpa
perlakuan perendaman antibiotik, dibilas kembali dengan air steril sebanyak 2
kali, masing-masing tiga menit. Sterilisasi lanjutan dilakukan dalam LAFC
dengan perendaman larutan NaOCl 7,5 % dan 5 % selama 3-5 menit, dan dibilas
dengan air steril sebanyak 4 kali, masing-masing selama 3 menit. Eksplan
kemudian dipotong menggunakan skalpel dengan panjang ± 1 cm di dalam cawan
Petri. Daun dan bekas bahan sterilisasi dibersihkan dan dibuang dari eksplan.
Setelah dipotong, eksplan direndam dalam larutan betadine selama 10 menit dan
dibilas kembali dengan menggunakan

air steril 1 kali. Selanjutnya, eksplan

ditiriskan dalam tissue steril yang diletakkan pada cawan Petri. Perlakuan yang
diberikan dalam penelitian ini meliputi:
A. Bibit tanpa karantina
A.1 Pengolesan permukaan eksplan dengan alkohol 70%
Perendaman dalam 100 ml larutan bakterisida, fungisida, dan detergen
Perendaman larutan NaOCl 7,5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan NaOCl 5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan betadine 10 menit
A.2 Pengolesan permukaan eksplan dengan alkohol 70%
Perendaman dalam 100 ml larutan bakterisida, fungisida, dan detergen
Perendaman eksplan dalam larutan antibiotik selama semalam
Perendaman larutan NaOCl 7,5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan NaOCl 5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan betadine 10 menit
A.3 Pengolesan permukaan eksplan dengan alkohol 70%
Perendaman dalam 100 ml larutan bakterisida, fungisida, dan detergen
Perendaman eksplan dalam larutan antibiotik selama dua malam
Perendaman larutan NaOCl 7,5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan NaOCl 5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan betadine 10 menit
B. Bibit dengan karantina 7 hari
B.1 Pengolesan permukaan eksplan dengan alkohol 70%
Perendaman dalam 100 ml larutan bakterisida, fungisida, dan detergen

14

Perendaman eksplan dalam larutan antibiotik selama semalam
Perendaman larutan NaOCl 7,5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan NaOCl 5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan betadine 10 menit
B.2 Pengolesan permukaan eksplan dengan alkohol 70%
Perendaman dalam 100 ml larutan bakterisida, fungisida, dan detergen
Perendaman eksplan dalam larutan antibiotik selama 2 malam
Perendaman larutan NaOCl 7,5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan NaOCl 5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan betadine 10 menit
C. Bibit dengan karantina 14 hari
C.1 Pengolesan permukaan eksplan dengan alkohol 70%
Perendaman dalam 100 ml larutan bakterisida, fungisida, dan detergen
Perendaman eksplan dalam larutan antibiotik selama semalam
Perendaman larutan NaOCl 7,5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan NaOCl 5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan betadine 10 menit
C.2 Pengolesan permukaan eksplan dengan alkohol 70%
Perendaman dalam 100 ml larutan bakterisida, fungisida, dan detergen
Perendaman eksplan dalam larutan antibiotik selama 2 malam
Perendaman larutan NaOCl 7,5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan NaOCl 5 % selama 3-5 menit
Perendaman larutan betadine 10 menit
Penanaman eksplan. Penanaman eksplan dilakukan di dalam LAFC.
Eksplan yang telah dipotong dengan ukuran ± 1 cm ditanam di botol-botol kultur
yang berisi media MS dengan bantuan pinset yang telah disterilisasi. Botol kultur
ditutup rapat dengan menggunakan plastik dan diikat dengan karet, lalu dilapisi
dengan aluminium foil, dilapisi dengan plastik kembali dan diikat dengan karet,
dan direkatkan dengan menggunakan plastik wrap. Botol kultur selanjutnya
diletakkan dalam rak-rak kultur.
Eksplan dalam botol kultur diamati setiap hari selama 1 bulan. Botol-botol
kultur yang sudah menunjukkan adanya eksplan yang terkontaminasi oleh

15

cendawan segera dipisahkan untuk menghindari penyebaran cendawan ke botol
kultur yang lain, sedangkan kontaminasi oleh bakteri tidak perlu dipisahkan
sampai akhir pengamatan.
3.4

Pengamatan dan Pengambilan Data
Peubah yang diamati meliputi persen kontaminasi bakteri, cendawan,

persen browning, persen hidup.
1. Persen kontaminasi bakteri
Persen kontaminasi bakteri diukur dengan cara menghitung jumlah tanaman
yang terkontaminasi mulai 1 hari setelah eksplan ditanam dan selanjutnya setiap
hari sampai akhir pengamatan, kemudian dihitung dengan rumus:
% Kontaminan= ∑ eksplan terkontaminasi bakteri/ ∑ eksplan yang ditanam.
2. Persen kontaminasi cendawan
Persen kontaminasi cendawan diukur dengan cara menghitung jumlah
tanaman yang terkontaminasi mulai 1 hari setelah eksplan ditanam dan
selanjutnya setiap hari sampai akhir pengamatan, kemudian dihitung dengan
rumus:
% Kontaminan= ∑ eksplan terkontaminasi cendawan/ ∑ eksplan yang ditanam.
3. Persen browning
Persen browning diukur dengan cara menghitung jumlah tanaman yang
mengalami browning mulai 1 hari setelah eksplan ditanam dan selanjutnya setiap
hari sampai akhir pengamatan, kemudian dihitung dengan rumus:
% browning = ∑ eksplan mengalami browning/ ∑ eksplan yang ditanam
4. Persen hidup
Persen hidup diukur dengan cara menghitung jumlah tanaman yang hidup
sampai akhir pengamatan, kemudian dihitung dengan rumus:
% hidup = ∑ eksplan hidup/ ∑ eksplan yang ditanam.
5. Persen multiplikasi
Persen

diukur dengan cara menghitung jumlah tanaman yang bisa

dimultiplikasi pada akhir pengamatan, kemudian dihitung dengan rumus:
% multiplikasi = ∑ eksplan dapat dimultiplikasi/ ∑ eksplan yang ditanam.

16

3.5

Analisis Data
Dalam penelitian ini terdapat 2 perlakuan yaitu karantina dan perendaman

antibiotik. Waktu karantina yang digunakan adalah 0 hari, 7 hari, dan 14 hari.
Waktu perendaman antibiotik yang digunakan adalah 0 hari, 1 hari dan 2 hari.
Penelitian dilakukan dengan 7 kombinasi perlakuan, yaitu karantina 0 hari dan
perendaman 0 hari, karantina 0 hari dan perendaman 1 hari, karantina 0 hari dan
perendaman 2 hari, karantina 7 hari dan perendaman 1 hari, karantina 7 hari dan
perendaman 2 hari, karantina 14 hari dan perendaman 1 hari, karantina 14 hari dan
perendaman 2 hari. Masing-masing kombinasi perlakuan diulang sebanyak 8 kali.
Setiap ulangan terdiri atas 5 satuan percobaan berupa botol kultur. Setiap botol
kultur hanya ditanami 1 eksplan. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.

17

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1

Hasil
Kontaminasi dan pencoklatan (browning) eksplan merupakan masalah

utama yang sering muncul pada tahap inisiasi. Inisiasi merupakan tahap awal
kultur jaringan yang bertujuan menghasilkan eksplan yang bebas dari
mikroorganisme kontaminan. Pengamatan kontaminasi dan browning dilakukan
terhadap kultur jaringan jabon selama 4 minggu. Eksplan berasal dari indukan
berumur ± 3 bulan yang diberi 2 macam perlakuan yaitu karantina dan lama
perendaman dalam antibiotik.
Tabel 2 Tingkat kontaminasi, kematian eksplan, browning dan tingkat hidup eksplan
jabon terhadap kombinasi perlakuan karantina dan perendaman antibiotik
Kombinasi
Kontaminasi
Kematian eksplan
Browning
Hijau
perlakuan
(%)
(%)
(%)
(%)
A0B0
92,50
85,00
10,00
15,00
A0B1
90,00
100,00
22,50
0,00
A0B2
90,00
97,50
5,00
2,50
A1B1
100,00
100,00
5,00
0,00
A1B2
95,00
100,00
2,50
0,00
A2B1
100,00
100,00
12,50
0,00
A2B2
97,50
100,00
15,00
0,00
Rata-rata
95,00
97,50
10,36
2,50
A0: karantina 0 hari, A1: karantina 7 hari, A2: karantina 14 hari, B0: perendaman 0 hari, B1:
perendaman 1 hari, B2: perendaman 2 hari

Tabel 3 Jenis kontaminan pada eksplan jabon
Jenis kontaminan
Bakteri
Cendawan
Bakteri+cendawan

Persentase(%)
9,28
10,36
75,36

Berdasarkan hasil penelitian, kontaminasi yang terjadi mencapai 95%,
kematian eksplan 97,5%, browning 10,36%, dan eksplan hidup sebesar 2,5% dari
seluruh eksplan yang ditanam Persentase kontaminasi eksplan tertinggi terdapat
pada perlakuan A1B1 dan A2B1 sebesar 100%, sedangkan persentase terendah
sebesar 90% pada kombinasi perlakuan A0B1 dan A0B2. Persentase kematian
eksplan 100% terjadi pada kombinasi perlakuan A0B1, A1B1, A1B2, A2B1 dan
A2B2, sedangkan 2 kombinasi perlakuan lainnya masih terdapat eksplan yang
masih hijau/hidup yaitu A0B0 (15%) dan A0B2 (2,5%). Persentase browning

18

eksplan teertinggi padda kombinaasi perlakuaan A0B1 seebesar 22,55% dan tereendah
pada kom
mbinasi perllakuan A1B
B2 sebesar 2,5% (Tabel 2). Jeniss kontamin pada
eksplan jaabon melipputi bakteri dan cendaawan. Perseentase konttaminasi ek
ksplan
oleh baktteri+cendaw
wan sebanyyak 75,36%
%, kontam
minasi cenddawan sebaanyak
10,36% daan kontaminnasi bakterii sebanyak 9,28%
9
(Tabel 3).
120

Bro
owning

Bahan
n sterilan

A
A0B1

A0B2
A
A1
1B1
A1B2
Kombinassi Perlakuan

Kontaminasi

Persentase (%)

100
80
60
40
20
0
A0B0

Gambar 2

A2B
B1

A2B2
2

Eksplan yang
y
mengaalami kemattian selama 4 minggu pengamatan
n (A0:
karantina 0 hari, A1:
A karantinaa 7 hari, A2:
A karantina 14 harii, B0:
man 0 hari, B11: perendamaan 1 hari, B22: perendamaan 2 hari)
perendam

120.0

B
Bakteri+cend
dawan

Cendaw
wan

Bakteri

Persentase (%)

100.0
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
A0B0

A0B1

A0B2

A1B1
A

A1
1B2

A2B
B1

A2B2
2

Kombinaasi perlakuann
minasi selam
ma 4 minggu pengamatann (A0: karan
ntina 0
Gambar 3 Eksplan yaang terkontam
hari, A1: karantina
k
7 hari, A2: karaantina 14 harri, B0: perenndaman 0 harri, B1:
perendamaan 1 hari, B1: perendaman
n 2 hari)

Keematian terrtinggi padaa semua peerlakuan steerilisasi dissebabkan karena
k
kontaminaasi kemudiaan diikuti bahan
b
steriilan dan brrowning (G
Gambar 2). Jenis

19

a
pada eksplan beerupa baktteri dan ccendawan. Jenis
kontaminaan yang ada
kontaminaan terbanyak pada sem
mua kombinaasi perlakuaan adalah baakteri+cend
dawan
kemudian diikuti hannya bakteri dan
d hanya cendawan
c
(G
Gambar 3).
120

Karantina 0 hari

Karanttina 7 hari

Karanttina 14 hari

Persentase (%)

100
80
60
40
20
0
Kontaminssi

Kem
matian eksplan
n

Brow
wning

Hijau

Kondiisi eksplan
Gambar 4 Pengaruh peerlakuan karaantina terhad
dap kondisi eksplan
e
jabonn pada mingg
gu
ke-4 pengaamatan

Peersentase koontaminasi dan kemaatian eksplan pada semua perlaakuan
eksplan yyang mengalami
karantina tinggi dibbandingkann dengan persentase
p
browning dan hijau//hidup. Perssentase kon
ntaminasi dan
d kematiaan eksplan pada
perlakuan karantina 7 hari dann 14 hari mempunyaii nilai yanng hampir sama.
s
matian eksplan pada perlakuan karantina 0 hari
Persentasee kontaminnasi dan kem
lebih renddah dibandinngkan denggan karantin
na 7 dan 144 hari. Persentase brow
wning
eksplan paada perlakuuan karantinna 0 hari dan
n 14 hari meempunyai nnilai yang haampir
sama. Perrsentase broowning padaa perlakuan
n karantina 7 hari lebihh rendah ap
pabila
dibandinggkan dengann karantinaa 0 hari dan
d
karantinna 14 harii. Eksplan yang
hijau/hiduup sampai akhir
a
pengaamatan terd
dapat pada perlakuan karantina 0 hari
(Gambar 4).
4

20

120

Perendaaman 0 hari

Perendaman 2 hari

Perenddaman 1 hari

Persentase (%)

100
80
60
40
20
0
Kontaminaasi

Kemaatian eksplan

Brownning

Hijau

Kondiisi eksplan
Gambar 5 Pengaruh peerlakuan pereendaman terrhadap kondisi eksplan jaabon pada minggu
m
ke-4 pengaamatan

Peersentase koontaminasi dan kemaatian eksplan pada semua perlaakuan
perendaman tinggi. Persentase
P
k
kontaminasi
eksplan paada perlakuaan perendam
man 0
hari, 1 haari dan 2 haari mempunnyai nilai yaang hampir sama. Perssentase kem
matian
eksplan pada perlakuuan perendaaman 1 dan
n 2 hari meempunyai niilai yang haampir
sama. Perrsentase kem
matian ekspplan pada perlakuan
p
p
perendaman
0 hari tereendah
dibandinggkan dengaan perlakuuan lainnyaa. Tingkat browningg eksplan pada
perlakuan perendam
man 2 hari mempunyaai presentasse terendahh. Eksplan yang
hijau/hiduup sampai akhir
a
pengam
matan terdaapat pada peerlakuan peerendaman 0 hari

Persentase (%)

dan 2 harii (Gambar 5).
5
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Cen
ndawan
Bak
kteri

I

I
II

III

IV
Hari ke--

V

VI

VIII

Gambar 6 Persentase kenaikan juumlah eksplaan yang menngalami konttaminasi bak
kteri dan
cendawan hingga
h
7 harri setelah pen
nanaman

21

p
hari kke-2 inisiasi dan
Koontaminasi bakteri dann cendawan terjadi pada
mengalam
mi kenaikan sampai harri ke-6. Kon
ntaminasi mencapai
m
perrsentase terttinggi
pada hari ke-5 dan mulai
m
konstaan pada harri ke-6 sam
mpai pada akkhir pengam
matan
6
(Gambar 6).

B

A

D

C

E

Gam
mbar 7 Kondiisi eksplan pada
p
minggu ke-4 pengam
matan; (A) Ekksplan
terkoontaminasi jaamur, (B) Ek
ksplan terkonntaminasi bakkteri,
(C) Eksplan
E
menngalami brow
wning, (D) Ekksplan hijau tetapi
tidakk mengalami pertumbuhaan,(E) Eksplaan yang siap
dimuultiplikasi

Daalam penellitian ini dihasilkan 3 botol eksplan jaabon yang siap
dimultiplikasi. Eksplan tersebut kemudian dipindahkaan kedalam media MS yang
menganduung ZPT BA
AP 1,5 mg//l. Eksplan yang
y
dipinddahkan ke ddalam media MS
dengan peenambahan ZPT mengaalami pertam
mbahan tinggi, ruas daan daun. Ko
ondisi
eksplan paada akhir peengamatan dapat
d
dilihaat pada Gam
mbar 7.

22

4.2

Pembahasan

4.2.1

Kondisi Bahan Tanaman
Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini merupakan tunas dari

tanaman jabon yang berumur ± 3 bulan yang merupakan tanaman dengan jaringan
muda yang sedang aktif tumbuh. Kavitha et al. (2009) melakukan penelitian
respon pertumbuhan eksplan jabon terhadap perbedaan jenis eksplan. Eksplan
jabon dari jaringan muda tanaman yang aktif tumbuh akan memberikan respon
pertumbuhan yang baik dalam kultur jaringan dibandingkan dengan tunas dorman
ataupun tunas yang sudah berkayu. Waktu bertunas dan banyaknya tunas eksplan
jabon akan maksimum apabila yang digunakan adalah jaringan muda yang sedang
aktif tumbuh, sedangkan jaringan tua tidak memberikan respon, bahkan akan
mengalami pencoklatan dan mati.
Naghmouchi et al. (2008) menyatakan bahwa eksplan carob (Ceratonia
siliqua) yang mempunyai karakteristik juvenile akan memberikan respon yang
bagus dalam pembentukan tunas dan kecepatan pembentukan akar dalam media
kultur. Penggunaan eksplan muda akan lebih optimal dalam pembentukan tunas
dibandingkan dengan penggunaan eksplan yang sudah berlignin. Respon eksplan
akan menurun seiring dengan naiknya umur eksplan.
Eksplan yang berasal dari jaringan tanaman yang masih muda memiliki
kandungan fenol yang lebih rendah dibandingkan jaringan tanaman yang sudah
tua. Penggunaan tanaman muda dapat mengurangi kemungkinan browning yang
terjadi pada eksplan.
4.2.2

Karantina Tanaman dan Perendaman Antibiotik
Karantina tanaman induk bertujuan untuk mempersiapkan bahan eksplan

yang sehat dan bebas dari kontaminan internal. Bahan eksplan yang sehat sangat
penting dalam kultur jaringan tanaman. Eksplan yang sudah terinfeksi patogen
kemungkinan besar akan terkontaminasi saat dikulturkan. Karantina dilakukan
dengan pemberian antibiotik, fungisida atau bakterisida secara kontinyu pada
tanaman yang akan dikulturkan. Hal ini bertujuan untuk mematikan ataupun
mengurangi mikroba yang ada di dalam jaringan tanaman. Pengontrolan
kontaminasi mikroba sangat sulit dilakukan terutama untuk tanaman berkayu yang
berasal dari lapangan (Bausher et al. 1998).

23

Karantina penting dilakukan karena sterilisasi permukaan tidak cukup
membunuh mikroba kontaminan. Konsentrasi bahan sterilisasi yang rendah dan
waktu yang singkat pada sterilisasi permukaan, tidak bisa membunuh mikroba
kontaminan. Namun, jika konsentrasi dan waktu perendaman eksplan dengan
bahan sterilisasi dinaikkan, mikroba akan terbunuh dan dapat mematikan eksplan.
Kegiatan karantina dilakukan sebagai kontrol pertumbuhan cendawan dan bakteri
secara kontinyu. Kegiatan karantina ini juga sebagai penurun tingkat kontaminasi
secara internal dan secara tidak langsung mengurangi besarnya konsentrasi bahan
sterilisasi serta lamanya waktu sterilisasi yang akan merusak eksplan.
Perendaman eksplan dengan antibiotik dilakukan sebagai bagian dari
sterilisasi internal jaringan eksplan. Eksplan yang telah terpotong masih
membutuhkan oksigen untuk melakukan aktivitas selnya. Eksplan tersebut
diberikan oksigen dengan menggunakan aerator dalam air kaya oksigen dalam
proses peredamannya. Seperti dalam proses karantina, perendaman antibiotik
dilakukan untuk membunuh ataupun mengeliminir mikroba yang ada di dalam
jaringan eksplan.
Kontaminasi eksplan paling rendah pada perlakuan tanpa perendaman. Hal
ini disebabkan jaringan eksplan yang sebelumnya dioles alkohol mengalami luka
dan saat perendaman mikroba dari jaringan eksplan yang lain akan sangat mudah
masuk jaringan yang luka. Air sebagai sarana metabolisme eksplan juga diduga
dapat memobilisasi mikroba ke jaringan eksplan. Dosis dan waktu perendaman
antibiotik yang tidak tepat juga mengakibatkan tujuan perendaman yaitu
menurunkan tingkat kontaminasi belum tercapai.
4.2.3

Tingkat Browning Eksplan
Browning (pencoklatan) merupakan gejala munculnya warna coklat pada

eksplan sehingga akan menghambat pertumbuhan eksplan. Queiroz et al. (2008)
mengemukakan bahwa browning terjadi akibat adanya enzim polifenol oksidase
yang mengakibatkan terjadinya oksidasi senyawa fenol menjadi quinon yang
memproduksi pigmen berwarna coklat ketika jaringan terluka. Kavitha et al.
(2009) mengatakan bahwa browning pada eksplan jabon adalah hal yang umum
terjadi karena adanya oksidasi dari senyawa fenol. Hal ini selaras dengan jenis
jabon yang memiliki senyawa fenol berupa tanin (Nugroho 2011). Senyawa fenol

24

ini mengalami oksidasi akibat adanya pelukaan terhadap eksplan. Senyawa fenol
yang teroksidasi pada media mengakibatkan eksplan tidak dapat mengambil
nutrisi dari media sehingga pertumbuhan eksplan terhambat dan akhirnya eksplan
akan mati.
Persentase browning pada penelitian ini rendah, yaitu sebesar 10,36%.
Usaha untuk mengurangi browning dalam penelitian ini diantaranya ialah
penggunaan bahan tanaman yang masih muda. Tanaman muda mempunyai
kandungan fenol yang lebih rendah dibandingkan dengan tanaman tua.
Kandungan fenol yang lebih rendah akan menurunkan tingkat browning yang
terjadi. Peristiwa pencoklatan pada eksplan saat ditanam dapat dikurangi dengan
melakukan pembilasan air secara berulang. Hal ini dilakukan untuk melarutkan
senyawa fenol yang ada dalam jaringan tanaman.
Kavitha et al (2009) menyarankan untuk menginkubasi eksplan jabon pada
medium baru di dalam ruangan yang gelap untuk mengurangi tingkat browning
yang terjadi. Onuoha et al. (2011) dalam penelitiannya untuk mencegah browning
pada kultur jaringan pisang (Musa parasidiaca) menyarankan untuk merendam
eksplan dengan menggunakan antioksidan berupa potassium sitrat-sitrat selama 2
jam sebelum dilakukan pengkulturan. Poudyal et al. (2008) mengkaji masalah
browning pada jenis pear Yali, Ainkansui dan Abbe Fetel. Poudyal menyarankan
penambahan asam askorbat atau dengan penambahan Polivinil Pirolidon (PVP)
pada media kultur, inkubasi eksplan pada kondisi gelap selama 96 jam, dan
perlakuan dingin dengan disimpan dalam kulkas selama 12 jam. Perlakuan ini
terbukti mampu mengontrol browning pada eksplan pear.
4.2.4

Tingkat Kontaminasi Eksplan
Secara umum, tingkat kontaminasi tinggi pada semua perlakuan. Penyakit

lodoh oleh serangan cendawan pada tanaman induk (Gambar 8) diduga
menyebabkan tingginya kontaminasi pada semua perlakuan. Patogen penyebab
penyakit lodoh ini dengan cepat akan menyebar ke jaringan tanaman. Hifa
patogen lodoh menyebar melalui tanah, dan infeksi patogen terjadi melalui
penetrasi langsung pada epidermis yang masih lemah yang melindungi jaringan
tanaman yang masih sukulen (Boyce 1961). Banyak jenis cendawan yang
berasosiasi dengan jaringan tanaman, dan umumnya akan menyebabkan

25

kontaminaasi pada ekksplan yang dikulturkan (Altan ett al. 2009). Tanaman yang
terlihat seehat dan segar, didugaa sudah teriinfeksi didaalam jaringgannya, sehingga
ketika tunnas dikultuurkan patoggen tersebu
ut akan ikuut terbawa dalam jariingan,
akibatnya cendawan akan cepat tumbuh dallam botol-bbotol kultur.. Oleh karen
na itu
dalam kultur jaringann sangat pennting pemak
kaian eksplaan yang bennar-benar sehat.

A

B

C

Gambar 8 Kondisi tannaman indukkan jabon dii rumah kacaa; (A) Konddisi tanaman jabon
yang sehatt, (B) Konddisi tanaman
n jabon yangg mulai tersserang lodoh
h, (C)
Kondisi sem
mai jabon yaang mati terk
kena serangann lodoh

Tinngkat kontaminasi ekksplan jabon
n lebih renndah pada perlakuan tanpa
karantina dibandingkkan dengann perlakuan
n karantina.. Kontaminnasi yang cukup
c
tinggi padda perlakuaan karantinaa diduga kaarena adanyya resisitenssi mikroba yang
terjadi padda tanaman yang diberiikan antbiottik. Resisiteensi ini terjaadi karena proses
p
karantina belum tunntas, sehinngga karanttina yang bertujuan membunuh
h dan
menguranngi mikrobaa justru akkan menghaasilkan mikkroba yangg lebih ressisten.
Suwandi (1992)
(
menngatakan baahwa mikrob
ba akan berrusaha beraadaptasi terh
hadap
toksisitas antibiotikk. Resistennsi muncull dengan adanya ffleksibilitas dan
kemampuan mikrobaa untuk beeradaptasi dengan
d
linggkungannyaa, dan resisstensi
tersebut akan
a
dituruunkan darii generasi ke generaasi sehinggga menghassilkan
mikroba yang
y
lebihh tahan terhhadap antib
biotik. Pennyebab lainn diduga karena
k
kombinasii dari tiga jenis antibiotik belu
um dapat berfungsi
b
m
maksimal. Tidak
T
efektifnyaa antibiotik ini disebabbkan karen
na kurangnyya dosis anntibiotik ataaupun
rentang waktu
w
pembeerian antibiootik yang ku
urang lama.

26

Kontaminasi secara umum dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu faktor
eksplan, faktor manusia, faktor media dan faktor lingkungan. Kontaminasi dari
faktor eksplan dicirikan dengan awal muncul sumber kontaminasi berasal dari
eksplan (Gambar 9A). Dalam penelitian ini banyak didapatkan juga kontaminasi
yang berawal dari ruas antar tangkai daun (Gambar 9D). Kavitha et al (2009)
mengatakan bahwa kontaminasi paling banyak dari kultur jaringan tunas jabon
adalah cendawan. Cendawan sebagian besar berawal dari stipula yang berada di
antara tangkai daun. Kontaminasi di bagian stipula dapat dihilangkan dengan
menggunakan bahan kimia pada eksplan. Dengan cara ini persentase kontaminasi
pada bagian stipula oleh cendawan dapat dikurangi. Kontaminasi ini biasa terjadi
akibat adanya sterilisasi permukaan yang tidak sempurna. Pemilihan bahan
sterilisasi, dosis serta lama waktu sterilisasi mempengaruhi keefektifan dalam
membunuh kontaminan yang ada di permukaan eksplan.
Kontaminasi yang muncul dari media juga terkadang bisa terjadi.
Kontaminasi dari faktor media disebabkan karena kurang rapatnya penutup botol
sehingga mikroba bisa masuk lewat celah penutup botol. Kontaminasi yang
berasal dari media kultur ditandai dengan munculnya cendawan atau bakteri
berawal pada media (Gambar 9B). Faktor manusia dan lingkungan juga menjadi
penyebab tingat kontaminasi yang cukup tinggi, kurang terampilnya pekerja serta
kurang sterilnya peralatan yang dipakai juga bisa mempengaruhi persen
kontaminasi

pada eksplan. Odutayo et al (2007) menyatakan bahwa ada

hubungan antara jenis kontaminan dengan lingkungan laboratorium, pekerja, dam
peralatan yang digunakan. Bakteri dan cendawan yang ditemukan sebagai
kontaminan, jenisnya sama dengan bakteri dan cendawan yang ada di udara
laboratorium, peralatan laboratorium, kulit pekerja, serta sarung tangan pekerja
ketika melakukan penelitian.
Secara umum, berdasarkan jenis kontaminan kontaminasi terdapat 2 jenis,
yaitu kontaminasi bakteri dan kontaminasi cendawan. Kontaminasi bakteri
dicirikan dengan adanya cairan putih bening pada media di pangkal eksplan yang
akan berubah menjadi putih pekat ataupun berubah warna. Kontaminasi cendawan
dicirikan dengan adanya hifa putih yang tumbuh pada botol kultur, baik itu
muncul dari media ataupun eksplan. Kondisi media kultur yang lembab dan

27

banyak mengandung
m
g nutrisi, menyebabkan
m
n pertumbuuhan cendawan lebih cepat
dari pada pertumbuhhan eksplannnya. Cend
dawan yangg menyeranng eksplan lama
kelamaan akan menutupi eksplann yang akhiirnya membbunuh eksplan (Gambarr 9C)

A

C

B

D

Gaambar 9 Konntaminasi cenndawan; (A) cendawan berawal
b
dari eksplan, (B)
cenndawan beraawal dari med
dia, (C) cenddawan tumbuuh cepat dan
meenutupi ekspllan, (D) cend
dawan yang berawal
b
darii sipula antarr
tanngkai daun

Koontaminasi bakteri
b
dann cendawan mulai munncul pada haari kedua in
nisiasi
dan terus meningkatt pada mingggu pertama. Kontamiinasi cendawan dan baakteri
mencapai persentasee tertinggi pada harri ke-5 settelah penaanaman ekssplan.
Kontaminnasi yang terjadi sebaanyak 95% dari selurruh eksplann yang ditaanam.
Sebagian besar ekspllan mengalaami dua jen
nis kontamiinasi sekaliggus yaitu baakteri
+cendawaan.

28

4.2.5

Toksisitas Antibiotik dan Bahan Sterilisasi
Antibiotik merupakan senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme

seperti cendawan dan bakteri yang digunakan untuk membunuh mikrorganisme
lain. Aktivitas

antibiotik ialah mengganggu kinerja sel bakteri. Aktivitas

antibiotik dalam mengganggu sel bakteri juga bisa mengganggu aktivitas sel
tanaman yang akhirnya mematikan eksplan. Cantika (2006) menyatakan bahwa
konsentrasi antibiotik yang terlalu tinggi akan dapat mematikan sel tanaman.
Pemakaian bahan-bahan sterilisasi dengan konsentrasi yang terlalu tinggi ataupun
waktu yang terlalu lama juga akan bersifat toksik bagi tanaman. Residu dari bahan
sretilan yang masih tertinggal di eksplan juga akan dapat mematikan eksplan jika
pembilasan kurang bersih.
Bahan sterilisasi digunakan untuk sterilisasi permukaan eksplan. Bahan
sterilisasi bersifat toksik, oleh karena itu konsentrasi tidak boleh terlalu tinggi dan
waktu sterilisasi tidak boleh terlalu lama. Bahan sterilisasi yang digunakan dalam
penelitian ini dan diduga mengakibatkan terjadinya kematian eksplan adalah
alkohol 70% dan NaOCl. Alkohol 70% merupakan bahan sterilisasi yang kuat dan
dapat membunuh kontaminan, akan tetapi jika terlalu banyak akan mematikan
jaringan

tanaman.

Dalam

penelitian

pendahuluan

dilakukan

percobaan

penggunaan alkohol 70% selama 3 menit, akan tetapi 85%−90% eksplan
mengalami kematian. Alkohol 70% digunakan dengan cara dioles di permukaan
eksplan, hal ini dimaksukan untuk menghilangkan kontaminan yang ada di
permukaan eksplan. Akan tetapi, Widyaningrum (2000) menyatakan bahwa
penggunaan alkohol 70% dapat mengakibatkan eksplan mengalami dehidrasi yang
diikuti pengeluaran klorofil dari jaringan eksplan. Hal ini dapat terlihat dari
hilangnya warna hijau pada eksplan jabon yang dioles dengan menggunakan
alkohol 70% (Gambar 10A). Hilangnya klorofil dari jaringan tanaman
mengakibatkan jaringan eksplan mati setelah ditanam.
NaOCl yang dipakai ialah konsentrasi 5% dan 7,5% selama 3−5 menit.
Konsentrasi dan waktu

perendaman yang terlalu tinggi akan mengakibatkan

rusaknya jaringan eksplan. Jaringan eksplan yang rusak ditunjukkan dengan mulai
memutihnya eksplan jabon ketika direndam dalam larutan NaOCl (Gambar 10B).
Eksplan ini akhirmya akan mati setelah beberapa hari ditanam dalam medium MS

29

N
yang terlalu rendah juuga tidak akan
(Gambar 10C). Koonsentrasi NaOCl
membunuuh kontaminnan. Hal inii sesuai den
ngan pernyaataan Zulfiqqar et al. (2
2009)
yang menneliti tentanng efek perrbedaan kon
nsentrasi NaOCl
N
terhaadap keefek
ktifan
menguranngi tingkat kontaminaasi eksplan
n alpukat (Persea am
mericana mill.).
m
Konsentraasi NaOCl yang tepaat dapat effektif dalam
m mengonttrol kontam
minasi
dengan seedikit kerusaakan pada eksplan.
e
NaaOCl meruppakan bahann sterilisasi yang
sangat efeektif dalam
m mengontrool tingkat kontaminasi
k
i, tetapi konnsentrasi NaOCl
N
yang dinaaikkan akann secara drrastis menaaikkan pulaa persen keematian ekssplan,
karena NaaOCl dalam
m konsentrassi tinggi bersifat toksik bagi tanam
man.

B

A

C

Gambar 100 Kerusakaan jaringan eksplan oleh bahan steerilisasi; (A)) eksplan menjadi
coklat seetelah dioless alkohol, (B
B) eksplan memutih kaarena NaOC
Cl, (C)
eksplan mengalami
m
k
kematian
akib
bat kerusakaan jaringan.

4.2.6 Keemungkinaan Dilakukaan Multipllikasi
Ekksplan jabonn yang tidakk mengalam
mi kontaminnasi dan tum
mbuh, seban
nyak 3
botol ekspplan

dilakkukan pemindahan kee media hoormon MS+
+BAP 1,5 mg/l.

Kavitha et
e al. (20099)

menyattakan BAP
P bisa mennghasilkan tunas sehatt dan

panjang dari
d tunas dari
d jabon. Konsentrasi
K
i paling baiik untuk peerbanyakan tunas
eksplan jaabon adalah dengan BA
AP 1 mg/l daalam mediuum ½ MS. K
Konsentrasi lebih
tinggi

Dokumen yang terkait

Dokumen baru

Sterilisasi Tunas Jabon untuk Mendapatkan Eksplan Steril secara in Vitro.