BAB 3
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1. ALAT-ALAT
1. Gelas Beaker pyrex
2. Gelas
Ukur Fisonss
3. Termometer 210
o
C Fissons
4. Sel Difusi 5.
Termostat Gallenkamp
6. Labu
ukur pyrex
7. Hot plate stirer 8. Plat kaca
9. Pipet Volume Griffin
10.Spektrofotometer UV-Visible
Shimadjzu 11.Magnetik
bar 12.Universal testing Machine
SC-2DE 13.Neraca
analitis 14.Scanning Electron Machine SEM
3.2. BAHAN-BAHAN
1. Natrium Alginat Wako Pure Chemical
2. Kitosan
Sigma-aldrich Germany
3. CaCl
2
s p.a.
E. Merck
4. Albumin
Bovine 5. Na-Salisilat s
p.a. E. Merck 6. Urea s
p.a. E. Merck 7. H
2
SO
4
p.a. E.
Merck 8. HgCl
2
s p.a.
E. Merck
9. KI s p.a. E. Merck
10. akuades
11. Asam Asetat glasial p.a. E. Merck
12. NaOH
p.a. E.
Merck
Universitas Sumatera Utara
3.3. PROSEDUR PENELITIAN 3.3.1. Pembuatan membran Kalsium Alginat-kitosan
Sebanyak 0.5 g kitosan didispersikan kedalam 12.5 ml akuades dan ditambahkan 2.5 ml asam asetat glasial sambil diaduk dengan magnetik bar untuk
mendapatkan campuran yang homogen. Ditimbang 0.5 g Na-Alginat dan dilarutkan dengan 12.5 ml akuades. Kedua larutan tersebut dibiarkan terpisah selama 1 malam.
Kedua larutan polimer tersebut dicampurkan dan ditambahkan larutan NaOH 2M sampai pH 5-6 dan dicetak di atas plat kaca, lalu didiamkan selama 1 malam, lapisan
tipis yang diperoleh kemudian direndam dengan CaCl
2
0,1M. Dicuci dengan akuades dan dibiarkan hingga kering.
3.3.2. Uji Kekuatan Tarik Membran Kalsium Alginat-Kitosan
Membran Kalsium Alginat-kitosan yang diperoleh diuji keteguhan tariknya dengan menggunakan alat ” Universal Testing Machine ” typr SC-2DE,Cap : 2000 kg,
Meg No : 6079 Made in Tokyo Jepang dengan pengujian : a.
Sampel yang akan diuji dibentuk sesuai dengan kriteria bahan dan alat b.
Alat dihidupkan warm up selama 1 jam c.
Alat dikalibrasi dan diaatur tombol beban yang ada di dalam alat d.
Diatur kecepatan alat untuk pengujian sampel dengan satuan mmmenit e.
Dipasang alat penjepit sampel uji atas dan bawah f.
Dicatat nilai dari hasil pengujian pada saat beban maksimum dan pada saat stroke g.
Print elastisitas pengujian sampel pada kertas grafik.
3.3.3. Uji Difusi Urea,Na-Salisilat dan Albumin Melalui membran Kalsium Alginat-kitosan
3.3.3.1.Pembuatan Larutan Induk Baku LIB Urea, Na-Salisilat dan Albumin 3.3.3.1.1.Pembuatan LIB urea
Ditambahkan 100 mg urea lalu dimasukkan kedalam 1000 ml labu ukur dan ditambahkan akuades hingga garis tanda, lalu dihomogenkan. Sehingga diperoleh
larutan induk baku urea dengan konsentrasi 100 mcgml.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3.1.2..Pembuatan LIB Na-Salisilat
Ditimbang 10 mg Na-Salisilat lalu dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml. Ditambahkan akuades hingga garis tanda, lalu dihomogenkan. Diperoleh larutan induk
baku Na-Salisilat dengan konsentrasi 100 mcgml
3.3.3.1.3.Pembuatan LIB albumin.
Ditimbang 10 mg albumin dan dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml.Ditambahkan akuades hingga garis tanda lalu dihomogenkan. Diperoleh larutan
induk baku albumin dengan konsentrasi 100 mcgml
3.3.3.2. Penentuan λ maksimum urea, Na-Salisilat dan Albumin.
3.3.3.2.1. Penentuan λ maksimum urea.
Dari LIB dipipet sebanyak 50 ml dan dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml. Lalu dipanaskan pada suhu 60
o
C selama 30 menit. Diteteskan regen Nessler sebanyak 0,5 ml dan dibiarkan selama 20 menit.Ditambahkan aquadest hingga garis tanda.
Diperoleh larutan urea dengan konsentrasi 50 mcgml.
3.3.3.2.2. Penentuan λ maksimum Na-Salisilat
Dari LIB dipipet 10 ml dan dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml. Ditambahkan
H
2
SO
4
0,1N hingga mencapai garis tanda. Diperoleh larutan Na-Salisilat dengan konsentrasi 10 mcgml dan diukur panjang gelombang serapannya.
3.3.3.2.3. Penentuan λ maks Albumin
Dari LIB dipipet 50 ml dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml.Ditambahkan akuades hingga garis tanda dan diperoleh larutan albumin dengan konsentrasi 500
mcgml dan diukur panjang serapannya.
3.3.3.3. Pembuatan kurva kalibrasi urea, Na-Salisilat dan Albumin .
3.3.3.3.1. Pembuatan kurva kalibrasi urea
Dari LIB dipipet masing-masing 0.5ml, 1ml, 5ml, 10ml, 20ml, 30ml, 40ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80ml, 90ml dan 100ml. Dimasukkan masing masing kedalam labu
ukur 100 ml. Dipanaskan hingga suhu 60
o
C selama 30 menit. Masing-masing ditambahkan dengan 0,5 ml regen Nessler dan dibiarkan selama 20 menit.
Universitas Sumatera Utara
Ditambahkan akuades hingga mencapai garis tanda. Diperoleh dengan konsentrasi 0,5: 1 ; 5; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100 dan masing masing diukur panjang
serapannya.
3.3.3.3.2. Pembuatan kurva kalibrasi Na-Salisilat
Dari LIB dipipet masing masing 1 ml, 2ml, 4ml, 6ml, 8ml, 10ml, 12ml, 14ml, 16ml, 18ml, 20ml dan 22 ml. Dimasukkan dalam labu ukur 100 ml. Lalu
ditambahkan H
2
SO
4
0,1 N sampai batas atas sehingga diperoleh larutan Na-Salisilat dengan konsentrasi 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 dan 22 mcgml.Diukur serapan
masing masing larutan tersebut.
3.3.3.3.3. Pembuatan kurva kalibrasi albumin
Dari LIB dipipet masing masing 0,1 ml ; 0,5ml; 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 30ml, 40ml, 50ml, 60ml, 70ml , 80ml, 90ml dan 100ml lalu dimasukkan kedalam labu
ukur 100ml. Kemudian ditambahkan akuades hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan albumin dengan konsentrasi 1, 5, 10, 20, 50, 100 , 200, 300, 400, 500, 600,
700, 800, 900 dan 1000 mcgml dan diukur panjang gelombangnya.
3.3.3.4.Uji Difusi 3.3.3.4.1.Uji difusi Urea
Ditempatkan membran kalsium alginat-kitosan diantara kedua bejana difusi. Dimasukkan 10 ml larutan urea 100 mcgml kedalam bejana difusi sebelah kiri A
dan disebelah kanan B dimasukkan akuades dengan volume yang sama. Sel difusi ditempatkan pada thermostat dengan suhu 37
o
C. Dengan selang waktu tertentu 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 dan 180 menit urea yang terdifusi kedalam bejana
B diambil sebanyak 1 ml. Setelah diambil pada bejana yang sama bejana B ditambahkan akuades dengan volume yang sama. Kemudian dipanaskan pada suhu
60
o
C selama 30 menit masing-masing larutan urea yang terdifusi. Ditambahkan 0,5 ml reagen nessler. Dibiarkan 20 menit dan diencerkan dalam labu takar 10 ml dengan
akuades. Kemudian diukur absorbansi larutan yang terdifusi.
3.3.3.4.2. Uji difusi Na-Salisilat.
Ditempatkan membran kalsium alginat kitosan diantara kedua bejana difusi. Dimasukkan 10 ml larutan Na-Salisilat 10 mcgml kedalam bejana difusi sebelah kiri
A dan disebelah kanan B dimasukkan akuadest dengan volume yang sama. Sel difusi ditempatkan pada thermostat dengan suhu 37
o
C. Dengan selang waktu tertentu
Universitas Sumatera Utara
1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 dan 180 menit larutan Na-Salisilat yang terdifusi kedalam bejana B diambil sebanyak 1 ml. Setelah diambil pada bejana yang
sama bejana B ditambahkan akuades dengan volume yang sama. Diencerkan dalam labu ukur 10 ml dengan menggunakan H
2
SO
4
0.1N. Kemudian diukur absorbansi larutan yang terdifusi.
3.3.3.4.3. Uji difusi Albumin
Ditempatkan membran kalsium alginat-kitosan diantara kedua bejana difusi. Dimasukkan 10 ml larutan Albumin 500 mcgml kedalam bejana difusi sebelah kiri
A dan disebelah kanan B dimasukkan akuades dengan volume yang sama. Sel difusi ditempatkan pada thermostat dengan suhu 37
o
C. Dengan selang waktu tertentu 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 dan 180 menit larutan Albumin yang
terdifusi kedalam bejana B diambil sebanyak 1 ml. Setelah diambil pada bejana yang sama bejana B ditambahkan akuades dengan volume yang sama.Diencerkan dalam
labu ukur 10 ml dengan akuades. Kemudian diukur absorbansi larutan yang terdifusi.
Universitas Sumatera Utara
3.4. BAGAN PENELITIAN. 3.4.1.Pembuatan Membran Kalsium Alginat-Kitosan.
0.5 g kitosan 0.5 g Na-Alginat
Akuades 12.5 ml Asetat glasial 2.5 ml
diaduk Dibiarkan 12 jam
Akuades 12.5 ml
Distirer 2jam Dibiarkan 12
jam
Larutan NaOH 2M hingga pH 5-6 Dicetak diatas plat kaca
Didiamkan 12 jam Membran alginat
kitosan Direndam CaCl
2
0.1M Dicuci dengan akuades
Dikeringkan
Membran kalsium alginat-kitosan
Universitas Sumatera Utara
3.4.2. Uji Kekuatan Tarik.
Membran kalsium Alginat Kitosan
Dipotong sesuai dengan ukuran pada alat
Dimasukkan kedalam universal testing machine
Uji Kekuatan Tarik Dihidupkan alat
Dikalibrasi Diatur kecepatan alat
Dipasang alat penguji sampel atas dan bawah
Dicatat nilai hasil pengujian
load stroke
Universitas Sumatera Utara
3.4.3. Uji difusi urea, natrium salisilat dan albumin. 3.4.3.1. Pembuatan larutan induk baku LIB dan penentuan
λ maksimum urea, natrium salisilat dan albumin.
3.4.3.1.1. Pembuatan LIB, penentuan λ maksimum dan kurva kalibrasi urea.
100 mg Urea Dimasukkan dalam labu ukur 1000 ml
Akuades hingga garis tanda Dihomogenkan
LIB Urea
Diambil 50 ml
Dimasukkan dalam labu ukur 100 ml Dipanaskan pada suhu 60
o
C 30 menit Regen nessler 0.5ml
Akuades hingga garis tanda
Uji maksimum Dipipet masing masing 1, 5, 10,
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90 dan 100 ml
Didiamkan selama 20 menit Dimasukkan dalam labu ukur 100
ml Dipanaskan pada suhu 60
o
C 30 menit
Regen Nessler 0.5ml
Akuades hingga garis tanda Diukur serapan dengan
maksimum 288 nm
Kurva Kalibrasi
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.1.2. Pembuatan LIB, penentuan λ maksimum dan kurva kalibrasi natrium
salisilat.
10 mg Na-Salisilat Dimasukkan dalam labu ukur 100 ml
Akuades hingga garis tanda Dihomogenkan
LIB Na-Salisilat
Diambil 10 ml Dipipet masing masing 1, 2, 4, 6, 8,
10, 12, 14, 20 dan 22 ml
H
2
SO
4
0.1 N hingga garis tanda
Dimasukkan dalam labu ukur 100 ml
Uji maksimum Dimasukkan dalam labu ukur
100 ml
Diukur serapan dengan maksimum 278 nm
Kurva Kalibrasi H
2
SO
4
0.1 N hingga garis tanda
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.1.3. Pembuatan LIB, penentuan λ maksimum dan kurva kalibrasi albumin.
10 mg Albumin Dimasukkan dalam labu ukur 100 ml
Akuades hingga garis tanda Dihomogenkan
LIB Albumin
Diambil 50ml Dimasukkan dalam labu takar
100 ml Akuades hingga garis tanda
Uji maksimum Dipipet masing-masing 0,1:0,5: 1, 2,
5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ml
Akuades hingga garis tanda Dimasukkan dalam labu ukur
100 ml
Diukur serapan dengan maksimum 237 nm
Kurva Kalibrasi
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.2 . Uji difusi urea
Membran Kalsium Alginat-Kitosan ditempatkan diantara 2 bejana
difusi
Bejana Difusi A Bejana Difusi B
dimasukkan 10 ml larutan urea 1000 ppm
dimasukkan 10 ml akuades
ditempatkan pada thermostat dengan suhu 37
o
C distirer
diambil 1arutan urea sebanyak 1 ml dengan selang waktu tertentu 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60,
90, 120, 150 menit yang terdifusi dari bejana B
ditambahkan 1 ml akuades pada bejana B dipanaskan pada suhu 60
o
C selama 30 menit ditambahkan 0,5 ml reagen nessler
diencerkan dalam labu takar 10 ml diukur absorbansi larutan yang terdifusi
didiamkan selama 20 menit
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.3. Uji difusi natrium salisilat
Membran Kalsium alginat-Kitosan
Bejana Difusi A Bejana Difusi B
ditempatkan diantara 2 bejana difusi
dimasukkan 10 ml larutan Na-Salisilat 100 ppm
dimasukkan 10 ml akuades
ditempatkan pada thermostat pada suhu 37
o
C distirer
diambil larutan Na-salisilat sebanyak 1 ml dengan selang waktu tertentu 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90,
120, 180 menit yang terdifusi dari bejana B
ditambahkan 1 ml akuades pada bejana B diencerkan dengan H
2
SO
4
0,1 N pada labu takar 10 ml
diukur absorbansi larutan yang terdifusi Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.4. Uji difusi albumin.
Membran Kalsium Alginat-Kitosan
Bejana Difusi A Bejana Difusi B
ditempatkan diantara kedua bejana difusi
dimasukkan 10 ml larutan albumin 100 ppm
dimasukkan 10 ml akuades
ditempatkan pada thermostat dengan suhu 37
oC
distirer diambil larutan albumin sebanyak 1 ml dengan selang waktu tertentu
3, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 menit yang terdifusi dari bejana B
ditambahkan 1 ml akuades pada bejana B diencerkan dengan akuades dalam labu takar 10 ml
diukur absorbansi larutan yang terdifusi Hasil
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. MEMBRAN KALSIUM ALGINAT-KITOSAN.
Membran kalsium alginat yang diperoleh adalah membran transparan yang memiliki ketebalan 210 m. Berikut adalah hasil pengukuran ketebalan membran
kalsium alginat kitosan dengan menggunakan mikrometer pada 5 posisi acak.
Tabel 2. Ketebalan membran kalsium alginat-kitosan.
Sampel Pengukuran mm
X
1
X
2
X
3
X
4
X
5
X Kalsium
Alginat-Kitosan 0.25 0.23 0.21 0.215 0.185 0.21
Membran kalsium alginat-kitosan yang dihasilkan mempunyai ketebalan sesuai dengan penggunaan membran hemodialisa dimana ukuran ketebalan membran
untuk difusi adalah 100-500 m. Dalam pembuatan membran, pada pH dibawah 5 membran tidak dapat
terbentuk dan pada kondisi pengeringan yang tinggi membran yang dihasilkan menjadi sangat rapuh dan mudah koyak. Jika pH lebih besar daripada 6, terjadi
netralisasi muatan positif kitosan sehingga kitosan dapat mengendap. Sebaliknya jika pH lebih kecil dari 3 bisa menurunkan biokompatibel sistem dan juga mengakibatkan
pengendapan alginat. Pada pH mendekati 5, gugus karboksilat dan gugus amino dari kitosan terprotonasi. Sehingga lebih banyak terjadi interaksi antara alginat dengan
kitosan Adriana et al, 2003. Akibatnya terdapat ikatan garam baru. Penelitian tentang enkapsulasi hemoglobin dalam butiran kitosan kalsium alginat kitosan pada
ph 2.4 dan 5.4. Gambar berikut menunjukkan bahwa pada pH 5.4 diperoleh retensi terbaik.
Universitas Sumatera Utara
Rantai Alginat
Knill et al,2004, Kumar 2000
Gambar 7. Interaksi Ionik antara alginat dengan kitosan pada pH 5.4
Cadenak dkk berhasil membuat membran kompleks polielektrolit alginat kitosan dengan cara mencampurkan larutan kitosan asetat dengan natrium alginat
sebelum diperoleh kompleks polielektrolit pada pH 5.28 melalui penambahan NaOH, campuran larutan ditambahkan HCl 32 terlebih dahulu.
Interaksi kitosan dengan natrium alginat dan penambahan kalsium klorida akan membentuk kompleks polielektrolit. Sebagai hasil pencampuran dua
polielektrolit akan dihasilkan kompleks membran tidak larut yang mampu melewatkan zat dengan berat molekul tertentu melalui pengembangan dalam air.
Dalam interaksi antara kalsium alginat dengan kitosan membentuk ikatan silang. Dimana ikatan silang tersebut memperkokoh ikatan kalsium alginat-kitosan
sehingga membran yang dihasilkan tidak mudah koyak.Berikut merupakan interaksi antara kalsium alginat-kitosan :
Gambar 8. Pembentukan khelat kalsium alginat-kitosan.
-
OOC NH
3 +
COOH
COO
-
Na
+ -
OOC AcNH
NH
3
Cl
-
H
2
N
Rantai Kitosan
Interaksi ionik
Universitas Sumatera Utara
4.2. SCANNING ELECTRON MICROSCOPE SEM