16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Radikal bebas dapat timbul melalui dua mekanisme utama yaitu, penimbunan energi ionisasi air oleh radiasi, elektron terepas, dan terjadi radikal
bebas , dan interaksi antara oksigen substansi lain, dan elektron bebas dengan reaksi oksidasi-reduksi Dalam hal ini akan terbentuk radikal superoksid
Underwood., 1994. Para ahli biokimia menyebutkan bahwa radikal bebas merupakan salah
satu bentuk senyawa oksigen reaktif. Senyawa ini terbentuk di dalam tubuh, dipicu oleh bermacam-macam faktor. Radikal bebas bisa terbentuk misalnya
ketika komponen makanan diubah menjadi bentuk energi melalui proses metabolisme. Pada proses metabolisme ini, seringkali terjadi kebocoran elektron
dan mudah terbentuknya radikal bebas. Misalnya hidrogen peroksida Winarsi, 2007.
Radikal bebas merupakan Reaktive Oxygen species ROS yang akan menyerang molekul lain disekitarnya sehingga menyebabkan reaksi berantai
terjadi dan menghasilkan radikal bebas yang beragam, seperti anion peroksida O
2 -
, dan hidrogen peroksida H
2
O
2
yang sudah dijelaskan sebelumnya, hidrogen bebas OH, asam hipoklorous HOCl, dan peroksinitrat ONOO
-
Vimala, et
al., 2003.
2.7 Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa-senyawa yang mampu menghilangkan, membersihkan, menahan pembentukkan ataupun memasdukan efek spesies
oksigen reaktif. Antioksidan merupakan senyawa pemberi donor electron donor atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu
menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Penggunaan senyawa antioksidan juga anti radikal saat ini
semakin meluas seiring dengan semakin besarnya pemahaman masyarakat tentang peranannya dalam menghambat penyakit generatif seperti penyakit jantung,
arteriosclerosis, kanker, serta gejala penuaan. Masalah-masalah ini berkaitan dengan kemampuan antioksidan untuk bekerja sebagai inhibitor penghambat
reaksi oksidasi oleh radikal bebas reaktif yang menjadi salah satu pencetus penyakit-penyakit diatas.
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Antioksidan terbagi menjadi dua yakni antioksidan enzim superoksida dismutase SOD, katalase dan glutation peroksidase GSH.Prx dan antioksidan
vitamin alfa tokoferol vitamin E, beta karoten dan asam askorbatvitamin C yang banyak didapatkan dari tanaman dan hewan .
Tubuh mengasilkan senyawa antioksidan, tetapi jmlahnya sering kali tidak cukup untuk menetralkan radikal bebas yang masuk kedalam tubuh. Sebagai
contoh tubuh dapat menghasilkan glutathione, salah satu antioksidan yang sangat kuat, hanya tubuh memerlukan asupan vitamin C sebesar 100 mg untuk memicu
tubuh mengasilkan glutathione ini. Kekurangan antioksidan dalam tubuh yakni memerlukan asupan dari luar Kuncahyo Sunardi., 2007; Winarsi 2007.
2.8 Uji Aktivitas Antioksidan
2.8.1 Metode DPPH
Pengukuran aktivitas antioksida dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain dengan metode lipid peroksida, tiobarbiturat, malonaldehid,8-karoten
bleaching, DPPH, dan tiosianat. Metode DPPH adalah salah satu yang paling populer karena praktis dan sensitif Molyneux, 2004. DPPH merupakan senyawa
radikal bebas yang stabil dan apabila digunakan sebagai pereaksi cukup dilarutkan,. Senyawa ini jika disimpan dalam keadaan dan kondisi penyimpanan
yang baik akan tetap stabil selama bertahun-tahun Winarsi, 2007. Prinsip pengujian antioksidan menggunakan DPPH adalah senyawa
antioksidan akan bereaksi dengan radikal DPPH melalui mekanisme donasi atom hidrogen dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke
kuning yang diukur pada panjang gelombang 515,5 nm Hanani et al.,2005. Rumus penghambatan aktivitas radikal bebas
Keterangan: inhibisi = persentase hambat antioksidan
A = absorbansi blanko
A
1
= absorbansi larutan uji inhibisi =
Ao-A
1
X 100 Ao
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Nilai IC
50
Inhibition Concentration adalah konsentrasi antioksidan
g mL
yang mampu menghambat 50 aktivitas radikal bebas. Suatu sampel dikatakan memiliki aktivitas antioksidan bila memiliki nilai IC
50
200 gmL. Nilai IC
50
diperoleh dari perpotongan garis antara daya hambatan dan sumbu konsentrasi, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan y = a + bx, dimana y = 50 dan nilai x
menunjukkan IC
50
Hanani et al, 2005.
Gambar 5 .Mekanisme penangkapan radikal DPPH oleh antioksian berupa donasi
proton Sumber: Prakash, Rigelhof, Miller,2001
2.8.2 Metode Reducing Power
Pada metode reducing power, antioksidan yang terdapat pada sampel akan mereduksi senyawa Fe
3+
menjadi senyawa Fe
2+
dengan cara memberikan satu elektron yang dimilikinya. Banyaknya jumlah Fe
2+
selanjutnya dapat diamati pada spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang maksimum 588-598 nm.
Peningkatan absorbansi atau penyerapan yang terjadi menunjukkan peningkatan reduksi yang bagus. Peningkatan reduksi yang bagus pada metode reducing power
berbanding lurus dengan konsentrasinya. Artinya semakin besar konsentrasi sampel maka semakin besar pula
tingkat reduksinya. Fe
3+
yang berwarna hijau akan mengalami reduksi menjadi Fe
2+
yang berwarna kuning Aiyegoro, 2009. Metode ini menggunakan kompleks FeCN
6 3-
sebagai pereaksi. Kompleks anion FeCN
6 3-
yang berwarna hijau akan berfungsi sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi FeCN
6 4-
yang berwarna kuning dengan reaksi sebagai berikut :
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Benzie dan Strain 1996, menggunakan FeTPTZ
2 3+
kompleks besi-ligan 2,4,6-tripiridil-triazin sebagai pereaksi. Kompleks biru FeTPTZ
2 3+
akan berfungsi sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi
FeTPTZ
2 2+
yang berwarna kuning dengan reaksi berikut:
2.8.3 Metode Aktivitas Radikal Bebas Nitrogen Monoksida
Metode Garrat telah diadopsi untuk menentukan aktivitas radikal bebas dari ekstrak air H. pedunculatum.Sodium Nitroprusside di dalam pelarut air pada
pH psikologis secara spontan menghasilkan nitrogen monoksida yang berinteraksi dengan oksigen untuk membentuk ion nitrit yang ditentukan dengan pereaksi
Grisses. Selanjutnya dianalisis nilai absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometri ultraviolet dan sinar tampak pada panjang gelombang 540 nm. Jumlah radikal bebas nitrogen monoksida yang dihitung berdasarkan nilai
absorbansinya yaitu : inhibisi =
Ao-A1 X 100
Ao
Dimana inhibisi merupakan persentase hambat antioksidan,Ao merupakan absorbansi sebelum reaksi dan A
1
merupakan absorbansi sesudah reaksi Aiyegoro, 2009.
2.8.4 Metode Aktivitas Radikal Bebas Ion Ferro Pembentukan Logam
Kelat
Aktivitas pembentukan khelat pada ion ferro diukur menurut Zao . Campuran pereaksi yang mengandung ekstrak, air destilasi, FeCl
2
dan ferrozine yang kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 40
o
C dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 562 nm. Setelah itu aktivitas
pembentukan khelat dihitung menggunakan rumus : FeTPTZ
2 3+
+ A
R
OH → FeTPTZ
2 2+
+ H
+
+ A
R
=O FeCN
6 3-
+ A- OH → FeCN
6 4-
+ H
+
+ A=O
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Rata-rata Khelat = [1-
A1-A2 ] X 100
Ao
dimana Ao merupakan nilai absorbansi kontrol positif tanpa tambahan eksrak, A
1
merupakan nilai absorbansi campuran reaksi, A
2
merupakan nilai absorbansi tanpa penambahan FeCl
2
Arora, 2011.
2.8.5 Metode Tiosianat
Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode ini didasarkan pada kemampuan senyawa antioksidan dalam menghambat terbentuknya radikal yang
reaktif.Pembentukan radikal
bebas disebabkan
oleh oksidasi
asam linoleat.Oksidasi lipid sering disebut autooksidasi karena reaksi tetap berlangsung
walaupun tidak ada zat pengoksidasi. Hasil oksidasi asam linoleat adalah malonaldehida dan radikal peroksida
yang reaktif. Radikal bebas yang terbentuk akan berubah menjadi senyawa karbonil, yaitu aldehida dan keton. Oksidasi asam linoleat membentuk
malonaldehid merupakan indikasi adanya oksidasi lemak Fardiaz, 1996. Selain itu, asam linoleat yang mengalami kerusakan akan menghasilkan senyawa
peroksida yang sangat reaktif dan bersifat radikal bebas. Penambahan antioksidan menyebabkan oksidasi asam linoleat terhenti Schulz, 1985.
Aktivitas antioksidan yang ditentukan dengan metode tiosianat membutuhkan suatu kontrol positif, pembanding ini biasanya merupakan senyawa
yang telah diketahui sifat antioksidannya seperti vitamin C, butil hidroksi toluen BHT atau tokoferol vitamin E. Oksidasi asam linoleat dalam kondisi buffer
yang diinkubasi pada suhu 37
o
C menggunakan FeCl
2
dan amonium tiosianat sebagai pereaksi oksodator dapat mengoksidasi Fe
2+
menjadi Fe
3+
sehingga menghasilkan warna merah darah yang menyerap sinar tampak pada panjang
gelombang 500 nm. Intensitas warna dinyatakan sebagai nilai absorbansi dengan pengukuran
menggunakan spektrofotometer
UVVis. Peroksida
lemak meningkatkan bilangan oksidasi Fe
2+
menjadi Fe
3+
yang kemudian bereaksi dengan ligan CNS
-
membentuk kompleks berwarna merah darah [FeCSN
6 3-
.
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.8.6 Metode Deoksiribosa
Reaksi degradasi gula deoksiribosa akan menghasilkan suatu produk karbonil dan dikarbonil di antaranya malonaldehid MDA. Adanya MDA dapat
dideteksi dengan asam tiobarbiturat TBA dalam suasana asam membentuk suatu kromogen yang berwarna merah muda.Jumlah kromogen MDA-TBA yang
terbentuk sangat bergantung dari jumlah deoksiribosa yang didegradasi. Semakin tinggi konsentrasi deoksiribosa yang ditambahkan akan menyebabkan
peningkatan absorbansi kromogen MDA-TBA Halliwell, 1999. Uji kemampuan antioksidan suatu sampel untuk menghalangi jalan
katalitik dari biosintesis pigmen melanin, pigmen yang membuat kulit putih. Tirosin mengatur tiga tahap di dalam jalan biosintesis melanin, dengan perubahan
tirosin menjadi dopa, dopa menjadi dopaquinone dan DHI menjadi indole-5,6- quinone Vimala, et al., 2003.
2.9 Spektrometer UV-
Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur serapan yang dihasilkan dari interaksi kimia antara radiasi elektromagnetik
dengan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada daerah ultraviolet 200-400 nm dan sinar tampak 400-800 nm.
Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuraan di daerah spektrum ultraviolet dan cahaya tampak terdiri dari suatu sistem optik dengan kemampuan
menghasilkan cahaya monokromatik dalam jangkauan 200 nm hingga 800 nm dan suatu alat yang sesuai untuk menetapkan serapan. Kedua sel yang digunakan
untuk larutan yang diperiksa dan larutan pembanding harus mempunyai karakteristik spektrum yang sama. Bila digunakan instrumen bekas ganda dengan
perekan, sel yang berisi pelarut ditempatkan pada jalur berkas pembanding. Jika tidak dinyatakan lain, serapan diukur pada panjang gelombang yang
ditetapkan degan menggunkan kuvet yang panjangnya 1 cm pada suhu 19
o
C hingga 20
o
C. Jika hal tersebut tidak sesuai untuk instrumen tertentu, panjang gelombang kuvet dapat diubah atau sebagai gantinya kadar dapat diubah, asalkan
telah ditunjukkan bahwa Hukum Beer dipenuhi untuk jangkauan kadar tersebut. Kecuali dinyatakan lain, pengukuran dilakukan terhadap pelarut yang digunakan
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
untuk membuat larutan uji sebagai pembanding. Dalam hal tertentu, pengukuran dilakukan terhadap suatu campuran pereaksi sebagai pembanding.
Suatu pernyataan dalam suatu penetapan kadar atau pengujian mengenai panjang gelombang serapan maksimum mengandung implikasi bahwa maksimum
tersebut tepat pada atau dalam batas 2 nm dari panjang gelombang yang ditetapkan Soemitro, et al., 1995. Suatu spektrofotometri UV-Vis tersusun dari
sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absobsi
antara sampel dan blanko ataupun pembanding Khopkar, 2003.
2.10 Krim
