III. BAHAN DAN METODE
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan dari bulan April hingga bulan September 2010 di Laboratorium Bioteknologi Tanah serta Laboratorium Kimia dan Kesuburan
Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian IPB.
3.2. Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain laminar flow, autoclave, spectrophotometer Spectronic 20-D Bausch and Lomb, oven,
timbangan, pipet, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas piala, dan alat-alat gelas lainnya.
Bahan utama penelitian ini berupa sampel tanah yang berada di sekitar kandang ternak sapi, kerbau, kambing, dan ayam. Penggunaan sampel tanah
tersebut dilakukan di sekitar kandang ternak dengan alasan bahwa tanah di sekitar kandang ternak tersebut mengandung nitrat yang merupakan komponen yang
terkandung dalam kotoran ternak. Kandungan nitrat yang tinggi pada sampel tanah tersebut diduga merupakan habitat yang sangat baik bagi populasi bakteri
penitrifikasi. Media yang digunakan untuk isolasi adalah media spesifik untuk Nitrosomonas
sp. Tabel 1 dan media spesifik untuk Nitrobacter sp. Tabel 2. Tahap seleksi dilakukan dengan dilakukan pengukuran konsentrasi amonium
dengan bahan yang digunakan berupa larutan Buffer sitrat, Na-Fenolat, dan NaOCl 5. Bahan yang digunakan untuk mengukur konsentrasi nitrat berupa
H
2
SO
4
pekat dan Brusin. Tabel 1. Media Spesifik untuk Isolasi Nitrosomonas sp. Verstraete, 1981 dalam
Iswandi, 1989 Komposisi
Jumlah per liter media NH
4 2
SO
4
0.5 g KH
2
PO
4
0.2 g CaCl
2
.2H
2
O 0.04 g
MgSO
4
.7H
2
O 0.04 g
Fe-sitrat 0.5 mg
Fenol-red pH 6.2-8.4 0.5 mg
Tabel 2. Media Spesifik untuk Isolasi Nitrobacter sp. Verstraete, 1981 dalam Iswandi, 1989
Komposisi Jumlah per liter media
KNO
2
0.006 g K
2
HPO
4
1.0 g NaCl
0.3 g MgSO
4
.7H
2
O 0.1 g
FeSO
4
.7H
2
O 0.03 g
CaCO
3
1.0 g CaCl
2
0.3 g
3.3. Metode dan Pelaksanaan Penelitian 3.3.1. Isolasi Bakteri Penitrifikasi
Proses isolasi bakteri penitrifikasi dilakukan dengan menggunakan metode Enrichment Culture
. Pertama-tama, dilakukan pengambilan sampel tanah pada 14 titik di sekitar kandang sapi, kerbau, kambing, ataupun ayam di beberapa lokasi di
sekitar Kabupaten Bogor Tabel 3. Pengambilan sampel tanah dilakukan secara komposit dengan ukuran ± 100 x 100 cm dan kedalaman 0-20 cm. Sebanyak 14
sampel tanah ini dikeringudarakan untuk selanjutnya dilakukan isolasi, sehingga diperoleh masing-masing 14 isolat bakteri penitrifikasi, yaitu bakteri pengoksidasi
amonium “Nitrosomonas” dengan kode isolat diawali huruf NS dan bakteri penghasil nitrat “Nitrobacter” dengan kode isolat diawali huruf NB dari tiap
sampel tanah yang diperoleh tersebut Tabel 3. Dengan demikian, akan diperoleh masing-masing 14 isolat “Nitrosomonas” dan “Nitrobacter”.
Tabel 3. Ternak, Kode Isolat, dan Lokasi Pengambilan Tanah Sebagai Sumber Isolat
Ternak Kode Isolat
“Nitrosomonas” Kode Isolat
“Nitrobacter” Lokasi Pengambilan Tanah Sebagai
Sumber Isolat Sapi
NSsp1 NBsp1
Ds. Pabuaran, Cilendek Kambing
NSkm1 NBkm1
Ds. Pabuaran, Cilendek Kambing
NSkm2 NBkm2
Ds. Bantar Sari, Bantar Kambing Kerbau
NSkb1 NBkb1
Ds. Bantar Sari, Bantar Kambing Kambing
NSkm3 NBkm3
Ds. Carang Pulang, Cikarawang Ayam
NSam NBam
Ds. Pabuaran, Cilendek Kerbau
NSkb2 NBkb2
Ds. Carang Pulang, Cikarawang Sapi
NSsp2 NBsp2
Peternakan Fapet IPB Sapi
NSsp3 NBsp3
Ds.Ciherang, Darmaga Sapi
NSsp4 NBsp4
Ds. Ciherang, Darmaga Sapi
NSsp5 NBsp5
Ds. Babakan Resmi, Bantar Kambing Kerbau
NSkb2 NBkb2
Ds. Bantar Sari, Bantar Kambing Sapi
NSsp6 NBsp6
Ds. Babakan Resmi, Bantar Kambing Kambing
NSkm4 NBkm4
Ds. Babakan Resmi, Bantar Kambing
Isolasi dengan metode enrichment culture ini dilakukan dengan cara sebanyak 1 g sampel tanah yang telah diperoleh diinokulasikan ke dalam masing-
masing 50 ml media spesifik untuk Nitrosomonas sp. Tabel 1 dan media spesifik untuk Nitrobacter sp. Tabel 2. Media spesifik tersebut berupa media cair. Kultur
cair berisi isolat tersebut dikocok dengan menggunakan shaker dan diinkubasi selama 7-10 hari. Adanya bakteri pengoksidasi amonium diindikasikan dengan
terjadinya perubahan warna media dari merah menjadi kuning yang disebabkan perubahan pH media akibat oksidasi amonium menjadi nitrit, sedangkan adanya
bakteri penghasil nitrat diindikasikan dengan perubahan warna media dari bening menjadi keruh.
Setelah diperoleh masing-masing 14 isolat bakteri penitrifikasi secara spesifik, kemudian masing-masing isolat tersebut dipindahkan ke dalam 50 ml
kultur yang baru dengan cara sebanyak 1 ml kultur berisi isolat dimasukkan ke dalam media baru tersebut. Kemudian diinkubasi kembali selama 5-7 hari sambil
dikocok dengan menggunakan shaker. Proses pemindahan kultur ke dalam media yang baru ini dilakukan sebanyak 4 kali.
Setelah dilakukan pemindahan sebanyak 4 kali ke dalam media yang baru, sebanyak masing-masing 14 isolat bakteri penitrifikasi tersebut disimpan dalam
bentuk kultur cair dengan pengocokan secara terus-menerus untuk selanjutnya dilakukan penetapan konsentrasi amonium dan nitrat. Selain dalam bentuk cair,
isolat yang diperoleh juga disimpan dalam media spesifik berupa agar miring untuk masing-masing bakteri penitrifikasi. Penyimpanan dengan agar miring ini
untuk dijadikan sebagai kultur stok atau kultur persediaan.
3.3.2. Seleksi Bakteri Penitrifikasi Berdasarkan Kemampuan Mengoksidasi Amonium dan Menghasilkan Nitrat
Seleksi kemampuan 14 isolat bakteri penitrifikasi yang telah diperoleh dalam mengoksidasi amonium NH
4 +
dan menghasilkan nitrat NO
3 -
ini dilakukan terhadap beberapa konsentrasi NH
4 2
SO
4
yang berbeda di dalam media baru, yaitu 250 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm NH
4 2
SO
4
. Tujuan dilakukannya seleksi dengan variasi konsentrasi NH
4 2
SO
4
yang berbeda ini agar diketahui konsentrasi yang tepat sehingga dapat meminimalisir penggunaan NH
4 2
SO
4
tersebut. Proses seleksi ini dilakukan hanya dengan mengukur konsentrasi amonium dan nitrat, sedangkan konsentrasi nitrit tidak diukur. Hal ini dikarenakan
proses oksidasi nitrit berjalan dengan cepat, sehingga yang diukur adalah nitrat. Seleksi dilakukan dengan sebanyak masing-masing 3 ml kultur bakteri
penitrifikasi dipindahkan ke dalam 30 ml media baru dengan konsentrasi NH
4 2
SO
4
yang berbeda-beda tersebut, lalu dikocok. Pengukuran kadar amonium dan nitrat ini dilakukan pada interval waktu tertentu, yaitu pada hari ke-0, ke-4,
ke-8, ke-12, dan ke-16. Setiap pengukuran juga dilakukan terhadap blanko. Blanko ini merupakan kultur tanpa isolat, yaitu berisi media spesifik untuk
Nitrosomonas dan Nitrobacter dengan variasi NH
4 2
SO
4
tersebut. Blanko ini dijadikan sebagai faktor koreksi untuk tiap pengukuran dan dapat dijadikan
indikator ada tidaknya kontaminasi. Pengukuran kadar amonium dilakukan dengan metode Penetapan
Amonium Biru Indofenol. Metode ini dilakukan dengan cara sebanyak 1 ml kultur ditambahkan dengan larutan Buffer Sitrat dan Na-Fenolat masing-masing
sebanyak 2 ml, dikocok dan didiamkan selama 10 menit. Setelah itu, ditambahkan dengan larutan NaOCl 5 hingga warna media berubah menjadi biru, lalu
dikocok dan didiamkan selama 30 menit. Setelah 30 menit, kadar amonium diukur dengan menggunakan Spectrophotometer pada panjang gelombang 636 nm
Sulaeman et al., 2005. Berbeda dengan amonium, penetapan kadar nitrat NO
3 +
dilakukan dengan Metode Brusin. Metode ini dilakukan dengan cara sebanyak 2,5 ml kultur
baru ditambahkan dengan 0,25 ml Brusin dan 2,5 ml H
2
SO
4
pekat sehingga warna media berubah menjadi kuning, dikocok dan didiamkan selama 60 menit. Setelah
60 menit, kadar nitrat diukur dengan menggunakan Spectrophotometer pada panjang gelombang 432 nm Sulaeman et al., 2005. Pengukuran nitrat ini juga
dilakukan pada selang waktu seperti halnya pengukuran amonium. Kultur yang mengalami penurunan kadar amonium tercepat dan menghasilkan kadar nitrat
tertinggi merupakan kultur yang paling baik. Selanjutnya, dari hasil pengukuran tersebut akan diseleksi isolat bakteri
penitrifikasi “Nitrosomonas” yang mampu mengoksidasi amonium dengan cepat dan isolat bakteri penitrifikasi “Nitrobacter” yang mampu menghasilkan nitrat
paling tinggi. Berdasarkan hasil seleksi, dipilih 5 isolat terbaik untuk masing- masing bakteri penitrifikasi, baik yang terdapat pada kultur dengan konsentrasi
250 ppm NH
4 2
SO
4
, 500 ppm NH
4 2
SO
4
, maupun 1000 ppm NH
4 2
SO
4
. Selain melakukan seleksi terhadap masing-masing isolat bakteri
penitrifikasi dari tiap konsentrasi NH
4 2
SO
4
, dilihat pula konsentrasi NH
4 2
SO
4
yang mampu dioksidasi secara optimal. Isolat bakteri penitrifikasi terbaik yang berasal dari konsentrasi NH
4 2
SO
4
yang mampu dioksidasi secara optimal itu selanjutnya akan digabungkan dan dikombinasikan satu dengan lainnya ke dalam
satu media baru untuk diukur kemampuannya dalam melakukan nitrifikasi. Penggabungan dan pengkombinasian ini dilakukan dengan cara sebanyak masing-
masing 2.5 ml isolat “Nitrosomonas” dan “Nitrobacter” yang memiliki kemampuan paling baik dimasukan ke dalam 50 ml media spesifik baru. Hasil
dari kombinasi antara 5 isolat dari masing-masing bakteri penitrifikasi tersebut diperoleh 25 pasangan isolat bakteri penitrifikasi. Kemudian, dari tiap pasangan
isolat tersebut, dipilih pasangan bakteri penitrifikasi yang mampu menurunkan konsentrasi amonium dengan cepat sekaligus meningkatkan konsentrasi nitrat.
Pasangan isolat yang demikian merupakan pasangan isolat bakteri penitrifikasi yang dapat melakukan proses nitrifikasi secara efektif.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori