commit to user
28
BAB III METODE PENELITIAN
A. Waktu Dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari-Juli 2010, di LPPT Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
B. Bahan Dan Alat
1. Bahan
Isolat 4 dan 5 rumput mutiara, Cell line HeLa HPV 18 dan SiHa HPV 16.
Bahan lain
adalah MTT
{3-4,5- dimethylthiazol-
2yl 2,5
diphenyltetrazoliumbromide} Sigma, Fetal Bovine Serum FBS Sigma, medium Roswell Park Memorial Institute RPMI 1640 Sigma, Fungison,
Streptomisin Sigma Penisilin Gibco BRL, SDS Stop Solution, DMSO, hepes dan tripsin Sigma Chem. CO. St. Louis. USA.
2. Alat
Microplate 96 sumuran Nunclone, sentrifuge Sigma 3K12 B. Braun Biotech International, blue tip dan yellow tip, incubator CO
2
Jacketed Incubator Nuaire
TM
IR autoflow, ELISA reader, hemocytometer New Bauer, tabung conical steril nunclone, scarper, tissue culture flask nunclone, laminar airflow
Nuaire, tangki nitrogen cair, mikroskop fluoresensi, mikroskop fase kontras
commit to user
29
Olympus, Jepang, mikropipet Soccorex, vorteks Genie, Timbangan elektrik Sartorius.
C. Cara Kerja
a. Pembuatan sampel uji
1. Larutan uji dibuat dengan melarutkan masing-masing isolat 4 dan 5 pada media RPMI 1640.
2. Larutan induk dibuat serangkaian seri kadar yang dibutuhkan dengan pengenceran menggunakan media RPMI 1640.
3. Seri kadar yang digunakan untuk uji sitotoksisitas adalah: 200, 100, 50, 25, 6.25, 3.125 1.5625, 0.78125, 0.390625 dan 0.1953125 ml, kontrol
positif doksorubisin, kontrol sel dan kontrol medium.
b. Preparasi sel Hela dan SiHa
1. Sel Hela dan SiHa ditumbuhkan hingga konfluen. 2. Media RPMI 1640 yang digunakan untuk menumbuhkan sel dibuang.
3. Kultur sel dipindahkan ke dalam conical tube berisi 20 ml media RPMI 1640 kemudian disentrifuge 2000 rpm selama 10 menit. Supernatan
dibuang kemudian diresuspensi dengan 10 ml media RPMI 1640. 4. Kerapatan sel dihitung dengan mengambil suspensi sel sebanyak 20 µl
lalu ditambahkan trypan blue sebanyak 180 µl, sel dihitung dengan bantuan haemocytometer pada mikroskop cahaya dengan perbesaran 100
commit to user
30
kali. Jumlah sel total yang diperoleh dibagi 4 dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan konstanta 10
4
ml.
c. Uji sitotoksisitas
1. Sebanyak 100 µl medium RPMI 1640 yang mengandung suspensi sel dengan kerapatan sekitar 2 × 10
4
selml dimasukkan ke dalam 93 sumuran Microplate 96 sumuran.
2. Isolat 4 dan 5 diberikan 100 µl pada peringkat konsentrasi yang berbeda secara triplet, dengan menggunakan mikropipet kemudian masing-masing
konsentrasi isolat sampel uji yang telah disiapkan dalam eppendorf steril dipindahkan ke dalam sumuran.
3. Hal yang sama juga dilakukan pada kontrol positif doksorubisin dan kontrol sel dalam media RPMI 1640, masing-masing dipindahkan ke
dalam sumuran. 4. Plate diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO
2
37°C dengan kadar CO
2
5. 5. Penambahan MTT 5 mgml pada akhir inkubasi sebanyak 100 µl setiap
sumuran. 6. Plate diinkubasi lagi selama 4 jam pada 37
o
C, CO
2
5. 7. Plate ditambahkan reagen stop solution yang bersifat detergenik SDS
10 dalam HCl 0,01 N 100 mlsumuran yang akan melarutkan formazan.
commit to user
31
8. Plate diinkubasi semalam pada 37
o
C, 5 CO
2
kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 550
nm Meiyanto et al., 2008.
d. Cara Memperoleh Data
Data absorbansi yang diperoleh dikonversi ke dalam persen sel hidup. Hasil pengamatan sel hidup ditampilkan dalam bentuk persentase sel hidup
dengan rumus: sel hidup =
x100 Meiyanto et al., 2005
Persentase kematian diperoleh dari hasil pengurangan 100 sel- sel hidup.
D. Analisis data
Kategori