Jenis dan Rancangan Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

21

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan, yaitu penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Eksperimental murni, yaitu pada penelitian dilakukan percobaan terhadap kelompok perlakuan yang dibandingkan dengan kelompok kontrol tanpa perlakuan. Rancangan acak ditunjukkan dengan pengacakan pada sampel yang bertujuan agar setiap sampel memiliki kesempatan yang sama untuk masuk ke dalam kelompok perlakuan ataupun kelompok kontrol. Lengkap ditunjukkan dengan adanya kelompok kontrol positif, kontrol negatif dan perlakuan. Pola searah ditunjukkan oleh satu perlakuan yang sama pada tiap kelompok perlakuan, yakni pemberian air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb..

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel Utama

a. Variabel bebas. Dosis pemberian air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb.. b. Variabel tergantung. Kadar glukosa darah tikus jantan galur Wistar yang dibebani glukosa. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Variabel Pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. 1 Subjek uji : tikus putih 2 Jenis kelamin : jantan 3 Galur spesies subjek uji : galur Wistar 4 Berat badan subjek uji : 150 – 200 gram 5 Umur subjek uji : 2 – 3 bulan 6 Jalur pemberian : peroral b. Variabel pengacau tak terkendali. Kondisi patologis tikus jantan galur Wistar yang dibebani glukosa.

3. Definisi Operasional

a. Dosis air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. adalah sejumlah volume air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. tiap satuan berat badan hewan uji dengan satuan mlkgBB. b. Uji Toleransi Glukosa Oral UTGO adalah metode penetapan kadar glukosa darah dengan memberikan beban glukosa kepada tikus dengan larutan glukosa secara oral dengan dosis 15 bv;1,75gkgBB. c. LDDK 0-240 kadar glukosa darah merupakan besaran yang menggambarkan jumlah kadar glukosa pada darah di rentang waktu menit ke-0 hingga menit ke-240 menggunakan metode trapezoid. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan Penelitian

a. Hewan uji. Tikus putih jantan galur Wistar, umur 2 – 3 bulan, berat badan 150 – 200 gram, diperoleh dari daerah Bantul. b. Bahan uji. Daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. yang diambil dari daerah kelurahan Patangpuluhan, Yogyakarta. c. Senyawa pembanding.Glibenklamida dari PT. Indofarma. d. Pereaksi untuk pengukuran kadar glukosa.Enzim Glucose GOD FS Diaysis®, Germany, dengan komposisi terlihat pada Tabel II. Tabel II. Isi Pereaksi Enzim Glucose GOD – PAP Reagen Phosphat buffer pH 7,5 250 mmolL Phenol 5 mmolL 4 – aminoantipyrine 0,5 mmolL Glukosa oksidase GOD ≥ 10 kUl Phenol Amino Antipirin Peroksidase PAP ≤ 1 kUl Glukosa standar 100 mgdl 5,5 mmoldl e. Lain-lain 1 EDTA, sebagai antikoagulan 2 Akuades 3 Akuabides 4 Glukosa monohidrat dosis 15 bv; 1,75 gkgBB, sebagailarutan yang digunakan untuk uji toleransi glukosa oral 5 CMC 1: sebagai kontrol normal dan pelarut glibenklamida

2. Alat Penelitian

a. Alat gelas beaker glass, labu takar, gelas ukur, pengaduk merk pyrex ® b. Jarum suntik per oral p.o c. Pipa kapiler d. Mikropipet e. Sentrifuge f. Tabung effendorf g. Tabung reaksi h. Vortex i. Microlab-200 j. Alat timbang elektrik k. Stopwatch

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dengan cara mencocokkan adanya kesamaan ciri daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. sesuai taksonominya.

2. Pengumpulan Bahan Uji

Daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. yang akan digunakan merupakan daun segar yang didapatkan dari tanaman daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. yang dipanen pada bulan September 2015 di daerah kelurahan Patangpuluhan, Yogyakarta.

3. Pembuatan Air Rebusan Daun Pandan Wangi Pandanus amaryllifolius

Roxb. Berdasarkan yang digunakan oleh masyarakat umum, 6 gram daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. direbus di dalam 400 mL akuades hingga mencapai 200 mL. Perebusan dilakukan di atas kompor dengan suhu 100º C selama 20 menit.

4. Perhitungan Dosis Pemberian Air Rebusan Daun Pandan Wangi

Pandanus amaryllifolius Roxb. Dosis pemakaian air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. untuk manusia dewasa 70 kg adalah 6 gram daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. yang direbus di dalam 400 mL akuades hingga mencapai 200 mL untuk satu kali minum. Konversi dosis manusia ke tikus 200 g adalah 0,018, sehingga dosis untuk tikus 200 gram sebagai berikut. 0, 018 x 6 gram = 0,108 g200gBB Dosis untuk 1 kg tikus: Besar dosis hasil perhitungan untuk tikus 200 gram adalah 540 mgkgBB. Dosis ini sebagai dosis terendah, selanjutnya dihitung dosis tertinggi. Dosis tertinggi dengan konsentrasi 75 gram200mL = 0,375 gmL, sehingga: D x BB = C x V D = D = 1,125 g200gBB = 5,625 gkgBB = 5625 mgkgBB Kemudian peringkat dosis dibuat dengan menggunakan faktor pengali. Faktor pengali ditentukan dengan rumus , sehingga = 3,23. Dari faktor pengali ini, didapatkan dosis tengah, yakni: D = 540 mgkgBB x 3,23 = 1744,2 mgkgBB D x BB = C x V 1744,2 mgkgBB x 200 g = C x 3 mL 1744,2 mgkgBB x 0,2 kg = C x 3 mL C = = 0,11628 gmL C = 0,11628 gmL = Bobot = 0,11628 gmL x 200 mL = 23,256 g Dari perhitungan di atas, didapatkan hasil dosis pertama 540 mgkgBB, dosis kedua 1744,2 mgkgBB, dan dosis terakhir 5625 mgkgBB.

5. Preparasi Bahan

a. Pembuatan larutan stok glukosa p.a 15,0 bv. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Glukosa monohidrat p.a ditimbang sebanyak 3,75 gram dan dilarutkan dengan akuades panas, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 mL dan ditambahkan akuades panas hingga batas tanda. b. Pembuatan larutan CMC 1 bv. Larutan CMC 1 bv digunakan sebagai kontrol negatif. CMC ditimbang sebanyak 1 gram dan dilarutkan ke dalam akuades, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan ditambahkan akuades hingga batas tanda. c. Penentuan dosis glibenklamida. Dosis glibenklamida untuk manusia 70 kgBB yaitu 5 mg, sehingga dosis untuk 200 g tikus yaitu: 5 mg glibenklamida x 0,018 = 0,09 mg glibenklamida 200 gBB = 0,45 mg glibenklamida kgBB d. Penentuan konsentrasi glibenklamida. Konsentrasi glibenklamida ditentukan menggunakan dosis yang telah diketahui dan volume yang telah ditetapkan, yaitu: D x BB = V x C 0,45 mgkgBB x 0,2 kgBB = 0,8 ml x C = C 0,1125 mgml = C

6. Orientasi Waktu Pemberian Glibenklamida

Orientasi menggunakan 12 ekor tikus yang terbagi ke dalam tiga kelompok kelompok menit ke-15, kelompok menit ke-30 dan kelompok menit ke-45 sebelum UTGO. Setiap kelompok mendapatkan perlakuan kontrol positif dan kontrol negatif. Pemberian dilakukan secara oral dan dilakukan UTGO menggunakan larutan glukosa monohidrat 15 bv; 1,75 gkgBB. Cuplikan darah diambil sesaat sebelum UTGO sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Kadar glukosa darah diukur mengunakan metode GOD – PAP, lalu kurva UTGO dibuat dan harga LDDK 0-240 dihitung. Waktu pemberian glibenklamida ditentukan berdasarkan nilai LDDK 0- 240 kontrol positif terkecil.

7. Orientasi

Dosis Pemberian Air Rebusan Daun Pandan WangiPandanus amaryllifolius Roxb. Dosis penggunaan air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. untuk manusia dewasa 70 kg adalah 6 gram daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb.. Konversi dari manusia 70 kg ke tikus 200 g, yaitu 0,018. Dosis untuk tikus 200 gram: 0,018 x 6 gram = 0,108 gram200gBB Dosis untuk 1 kg tikus = = 0,54 gramkgBB = 540 mgkgBB Dosis di atas kemudian digunakan sebagai dosis tertinggi. Peringkat dosis dibuat dengan menurunkan 1,5 kali dari dosis tertinggi, sehingga diperoleh dosis tengah sebesar 360 mgkgBB, dan dosis terendah sebesar 240 mgkgBB. Orientasi dilakukan dengan menggunakan tiga peringkat dosis tersebut. Pemberian dilakukan secara oral, diberikan pada menit ke-30 sebelum UTGO. Setiap kelompok perlakuan diberikan larutan glukosa monohidrat 15 bv; 1,75 gkgBB. Cuplikan darah diambil sesaat sebelum UTGO sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Kadar glukosa darah diukur mengunakan metode GOD – PAP, lalu kurva UTGO dibuat dan harga LDDK 0-240 dihitung.

8. Orientasi Waktu Pemberian Air Rebusan Daun Pandan Wangi

Pandanus amaryllifolius Roxb. Waktu pemberian air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. mengikuti hasil orientasi waktu pemberian glibenklamida. Waktu pemberian glibenklamida sendiri ditentukan berdasar harga selisih LDDK 0- 240 kontrol positif dan negatif terbesar dan nilai LDDK 0-240 kontrol positif terkecil. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

9. Tahap Percobaan

Gambar 4. Skema Penelitian a. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji Penelitian ini menggunakan 30 ekor tikus yang dibagi secara acak ke dalam enam kelompok, dimana setiap kelompok terdiri dari lima ekor tikus. Setiap hewan uji diadaptasikan pada kondisi yang sama selama tujuh hari, dihindarkan dari stress, diletakkan pada tempat yang jauh dari kebisingan, diberi pakan dan minum ad libitum. Sebelum mendapat perlakuan, setiap kelompok dipuasakan selama 10 – 16 jam dan tetap diberikan minum ad libitum, kemudian diberi pelakuan sebagai berikut: Kelompok 1 : Kontrol normal, hewan uji hanya diberi CMC 1 20 mlkgBB tanpa terbebani glukosa. Kelompok 2 : Kontrol positif, hewan uji diberi glibenklamida dengan dosis 0,45 mgkgBB dan terbebani glukosa dengan dosis 15 bv; 1,75 gkgBB. Kelompok 3 : Kontrol negatif, hewan uji diberikan CMC 1 20 mlkgBB dan terbebani glukosa dengan dosis 15 bv; 1,75 gkgBB. Kelompok 4 : Perlakuan, hewan uji diberiair rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. dosis 540 mgkgBB dan terbebani glukosa dosis 15 bv; 1,75 gkgBB. Kelompok 5 : Perlakuan, hewan uji diberi air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. dosis 1744,2 mgkgBB dan terbebani glukosa dosis 15 bv; 1,75 gkgBB. Kelompok 6 : Perlakuan, hewan uji diberi air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. dosis 5625 mgkgBB dan terbebani glukosa dosis 15 bv; 1,75 gkgBB. Setiap kelompok uji diberikan perlakuan secara per oral. Cuplikan darah diambil beberapa menit sebelum UTGO yang berdasarkan hasil orientasi glibenklamid dan berfungsi sebagai menit ke-0, kemudian dilanjutkan UTGO dengan memberikan larutan glukosa monohidrat dosis 15 bv; 1,75 gkgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan pada menit ke – 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Dilakukan pengukuran kadar glukosa darah menggunakan metode enzimatik GOD – PAP, kemudian dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDDK 0-240 . PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI b. Penetapan kadar glukosa darah Penetapan kadar glukosa darah menggunakan metode GOD – PAP. Darah tikus diambil melalui mata tikus vena orbitalis sebanyak 0,5 mL dan ditampung di dalam tabung Effendorf ® , kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Plasma darah diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan reagen dan divortex, lalu diukur absorbansinya menggunakan Microlab –200. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan di laboratorium Fisiologi – Biokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Tabel III. Volume Pengukuran Kadar Glukosa Darah Bahan Sampel ml Standar ml Blanko ml Supernatan 0,01 - - Larutan baku glukosa - 0,01 - Pereaksi GOD – PAP 1,00 1,00 1,00

E. Tata Cara Analisis Hasil

Dilakukan uji distribusi pada data LDDK 0-240 menggunakan uji Kolmogorov Smirnov . Apabila distribusi termasuk normal, maka dapat dilanjutkan dengan analisis One Way ANOVAdan Post Hoc Test Scheffe dengan tingkat kepercayaan 95. Apabila nilai LDDK 0-240 memiliki variansi yang berbeda, maka dapat dilakukan uji Kruskal Wallis yang dilanjutkan uji Mann Whitney dengan tingkat kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan tiap kelompok apakah bermakna p 0,05 atau tidak bermakna p 0,05. 33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan bahwa tanaman yang akan digunakan dalam pengujian efek penurunan kadar glukosa darah telah sesuai sehingga dapat meminimalisir kesalahan dalam pengambilan bahan yang akan digunakan sebagai bahan uji. Determinasi tanaman dilakukan di Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dilakukan dengan menyamakan ciri – ciri yang dimiliki oleh daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. dengan taksonomi yang tertera. Hasil determinasi membuktikan bahwa tanaman yang dideterminasi merupakan tanaman daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb. yang benar.

B. Hasil Percobaan Pendahuluan

Percobaan pendahuluan dilakukan dengan menentukan waktu pemberian glibenklamida dan penetapan dosis pemberian air rebusan daun pandan wangi Pandanus amaryllifolius Roxb..

1. Penetapan Waktu Pemberian Glibenklamida

Penetapan waktu pemberian glibenklamida bertujuan untuk mendapatkan waktu yang optimal agar mendapatkan persentase penurunan kadar glukosa darah yang terbesar. Persentase penurunan kadar glukosa darah terbesar diperoleh dari penurunan harga luas daerah yang terdapat di bawah kurva dari menit ke-0 hingga