18
merupakan golongan senyawa fenol yang bersifat asam, sehingga menimbulkan perubahan warna yang khas dengan adanya amonia Markham, 1988. Jika tidak
tercampur dengan pigmen lain, flavonoid dapat dideteksi dengan uap amonia dan akan menimbulkan warna yang spesifik untuk masing-masing golongan. Flavon
dan flavonol memberikan warna kuning kemerahan. Antosianin berwarna merah biru, sedangkan flavanon memberikan warna oranye atau coklat. Warna merah
dan lembayung yang mendadak dalam suasana basa disebabkan oleh adanya khalkon atau auron Robinson, 1995.
Tabel II. Hubungan warna bercak dengan struktur flavonoid Mabry et al., 1962
Warna bercak flavonoid UV 366 nm
NH
3
UV 366 nm Tipe flavonoid
Violet tua
Kuning, kuning hijau atau hijau
Perubahan warna sedikit atau tanpa
perubahan warna Biru muda
merah atau jingga a.
Biasanya 5-OH flavon atau flavonol tersulih ada 3-O dan
mempunyai 4’-OH b.
Flavanon 5-OH dan 4’-OH khalkon tanpa OH pada cincin B
a. flavon atau flavonol tersulih pada
3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas.
b. 6- atau 8-OH flavon dan flavonol
tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH
c. Isoflavon, dihidroflavonol,
biflavonil dan flavanon dengan 5-OH
d. Calkon dengan 2’- atau 6’-OH
tetapi tidak memiliki 2- atau 4- OH bebas
flavanon dengan 5-OH calkon dengan gugus hidroksil
bebas pada posisi 2- atau posisi 4-
Fluoresensi biru muda Fluoresensi hijau-
kuning atau hijau-biru a.
flavon dan flavanon yang tak mengandung 5-OH, misalnya 5-
OH-glikosida b.
flavonol tanpa 5-OH bebas tetapi tersulih pada 3-OH
19
Perubahan warna sedikit atau tanpa
perubahan warna Fluoresensi murup biru
terang Isoflavon yang tak mengandung 5-
OH bebas Isoflavon yang tak mengandung 5-
OH bebas
Tidak tampak Fluoresensi biru muda
Isoflavon yang tak mengandung 5- OH bebas
Kuning redup dan kuning atau
fluoresensi jingga Perubahan warna
sedikit atau tanpa perubahan warna
Flavonol dengan 3-OH bebas dan atau tanpa 5-OH bebas kadang-
kadang berasal dari dihidroflavonol
Fluoresensi kuning ,
Jingga atau merah Auron yang mengandung 4’-OH
bebas dan calkon 2- atau 4-OH
Kuning-hijau atau hijau-biru atau hijau
Perubahan warna sedikit atau tanpa
perubahan warna a.
Auron yang tak mengandung 4’- OH bebas dan flavanon tanpa 5-
OH bebas b.
Flavanol yang mengandung 3- OH bebas dan dengan atau tanpa
5-OH bebas Merah jingga redup
atau merah senduduk Biru
Antosianidin 3-glikosida Merah jambu atau
fluoresensi kuning Biru
Antosianidin 3,5-diglikosida
Hasil dari KKt 2A ini dapat juga digunakan untuk mengisolasi flavonoid dengan cara bercak yang sesuai digunting dari kromatogram, lalu bercak yang
sama digabungkan dan setelah digunting menjadi potongan kecil-kecil diekstraksi dengan pelarut yang sesuai biasanya digunakan metanol MeOH. Bila
diperlukan, hasil pemisahan KKt 1A dapat digabungkan dengan hasil pemisahan KKt 2A hasil replikasi agar diperoleh flavonoid murni Markham, 1988.
C. Spektrofotometri
Spektrofotometri merupakan studi mengenai interaksi cahaya dengan atom-atom atau molekul. Ada dua sifat radiasi elektromagnetik yaitu teori
Gelombang dan teori Korpuskuler. Teori gelombang digunakan untuk PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
menerangkan parameter elektromagnetik berupa kecepatan, frekuensi, panjang gelombang, dan amplitudo.
Untuk menggambarkan interaksi antar radiasi elektromagnetik dengan benda, maka dianggap berkas sinar sebagai suatu foton partikel yang bertenaga,
dimana tenaga setiap foton berbanding lurus dengan frekuensi radiasi. Dinyatakan dengan rumus :
E = h . f E = h . cn.
λ ket:
E = tenaga foton erg h = tetapan Planck 6,624 x 10
-34
joule det f = frekuensi radiasi magnetik Hertz
Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektroskopi UV tergantung pada struktur elektromagnetik dari molekul. Spektra UV dari senyawa organik
berkaitan dengan transisi-transisi diantara tingkatan energi elektronik, transisi tersebut meliputi orbital ikatan dan orbital anti ikatan. Panjang gelombang serapan
merupakan ukuran dari perbedaan-perbedaan energi transisi dari orbital tersebut. Pemisahan energi terbesar terjadi bila elektron ikatan tereksitasi yang
akan menimbulkan serapan pada daerah serapan 120-200 nm daerah UV vakum dan relatif tidak memberikan penjelasan. Dan diatas 200 nm eksitasi elektron dari
orbital p dan d dan orbital phi π terutama terkonjugasi π dapat diukur spektranya
sehingga memberikan keterangan berguna pada struktur molekulnya. Dalam hal ini spektroskopi UV terbatas pada sistem-sistem terkonjugasi, akan tetapi
mempunyai keuntungan yang selektif dari serapan UV di mana gugus-gugus PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
karaktenstik dapat dikenal dalam molekul-molekul yang sangat komplek Beberapa istilah dalam spektroskopi ultra violet UV :
1. Gugus kromofor
Gugus tidak jenuh kovalen yang dapat menyerap sinar tampak dan lembayung 200-800 nm yang disebabkan adanya transisi elektron.
2. Gugus auksokrom
Gugus fungsional bcrsifat jenuh yang tidak menyerap sinar diatas 200 nm akan tetapi jika terikat pada suatu gugus kromofor maka akan menggeser
puncak serapan gugus kromofor tersebut kepanjang gelombang yang lebih panjang dan mempertinggi intensitasnya.
3. Pergeseran batokromik
Pergeseran puncak serapan ke panjang gelombang yang lebih tinggi. 4.
Pergeseran hipsokromik Pergeseran puncak serapan ke nilai panjang gelombang yang lebih rendah.
5. Efek hiperkromik
Peristiwa bertambah besamya intensitas suatu gugus kromofor. 6.
Efek hipokromik Peristiwa bertambah kecilnya intensitas serapan suatu gugus kromofor.
Sastrohamidjoyo, 1985
D. Identifikasi Flavonoid secara Spektrofotometri UV
Penentuan struktur flavonoid akhir-akhir ini banyak dilakukan dengan cara spektrofotometri. Pada spektrofotometri UV cara ini didasarkan pada
pengetahuan bahwa senyawa flavonoid atau isoflavonoid memiliki sistem PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
aromatic terkonjugasi, sehingga menghasilkan serapan spektrum pada daerah UV. Senyawa flavonoid memberikan 2 puncak serapan utama. Dua puncak utama
tersebut biasanya menunjukkan pita I yang terletak pada panjang gelombang 300- 380 nm dan pita II terletak pada daerah dengan panjang gelombang 240-280 nm.
Pita 1 menunjukkan absorbsi unluk cincin B dengan sistem sinamoil, sedang pita II berhubungan dengan absorbsi cincin A yaitu sistem benzoil Mabry et
al .,1970.
Gambar 4. Pembagian cincin flavonoid Mabry et al., 1970 Ket : 1 Komponen penyerap benzoil sebelum garis lurus.
2 Komponen penyerap sinamoil sebelum garis lurus. Tabel III. Rentangan serapan maksimum Spektrofotometri UV Flavonoid
