24
a. Spektrum Natrium Hidroksida NaOH
Spektrum ini merupakan petunjuk “sidik jari” pola hidroksilasi dan juga bermanfaat untuk mendeteksi gugus hidroksi yang lebih asam dan tidak
tersubtitusi. Degradasi atau pengurangan spektrum setelah waktu tertentu merupakan petunjuk baik adanya gugus yang peka terhadap basa. Pada
flavonol dan flavon digunakan untuk mendeteksi adanya gugus 3 dan 4,-OH.
b. Spektrum Natrium Asetat NaOAc
Natrium asetat hanya menyebabkan pengionan yang berarti pada gugus hidroksi flavanoid yang paling asam. Jadi natrium asetat digunakan
terutama untuk mendeteksi adanya gugus 7 hidroksi bebas atau yang setara.
c. Spektrum Natrium Asetat dan Asam Borat NaOAcH
3
BO
3
NaOAcH
3
BO
3
menjembatani kedua gugus hidroksi pada gugus orthodihidroksi dan digunakan untuk mendeteksinya.
d. Spektrum Alumunium Klorida dan Asam Klorida AlCl
3
dan HCl
Pereaksi ini menyebabkan gugus OH pada C-3 dan C-5 flavon dan flavonol akan membentuk kompleks yang stabil, sedangkan kompleks antara
AlCl
3
dan gugus orthodihidroksi bersifat labil sehingga terdekomposisi dengan penambahan asam. Adanya gugus orthodihidroksi pada cincin B dapat
diketahui dengan penambahan asam terhadap spektra AlCl
3.
Keberadaan gugus 3-OH dan 5-OH pada flavon dan flavonol dapat diketahui dengan pereaksi ini.
25
Tabel IV. Penafsiran spektra UV dengan penambahan NaOH Markham, 1988.
Pergeseran panjang gelombang puncak Jenis flavonoid
I II Petunjuk penafsiran
Intensitas menurun terus
terjadi peruraian 3 dan 4’-OH, o-diOH
pada cincin A dan pada cincin B: 3-OH
yang berdampingan
Mantap + 40-65nm Intensitas tidak
menurun 4’-OH
Mantap + 60-65nm 3-OH tidak ada 4’-
OH bebas Flavon
Flavonol
Pita baru bandingkan MeOH 320-335nm 7-OH Tidak ada
pergeseran Tidak ada OH
dicincin A Intensitas menurun
dengan berjalannya waktu
o -diOH pada cincin A
penurunan lambat : o
-diOH pada cincin B isoflavon
Bergeser dari kira- kira 280 ke 325nm
Flavonol dan dihidroflavonol
dengan 5,7-OH Isoflavon
Flavanon Dihidroflavonol
Intensitas naik ke 330-340nm
7-OH tanpa 5-OH bebas
+ 80-95nm intensitas naik
4’-OH auron + 60-70nm
intensitas naik 6-OH tanpa
oksigenasi pada 4’- OH auron
Pergeseran lebih kecil
6-OH dengan oksigenasi pada 4’-
OH auron
+ 60-100nm intensitas naik
tanpa kenaikan intensitas
4-OH calkon 2-OH atau 4’-OH dan
tanpa –OH Calkon
Auron
+ 40-50nm 4’-OH 2’-OH atau 4-
OR juga ada PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Tabel V. Penafsiran spektra UV dengan penambahan NaOAc Markham, 1988.
Pergeseran panjang gelombang puncak
Jenis flavonoid I II
Petunjuk
+5-20nm berkurang bila
ada oksigenasi pada 6 atau 8
7-OH Flavon
Flavonol Isoflavon
Intensitas berkurang dengan bertambahnya waktu
Gugus yang peka terhadap basa, -OH
pada 6,7 atau 7,8 atau 3,4’
Flavonon + 35nm
+ 65nm 7-OH dengan 5-OH
7-OH tanpa 5-OH Dihidroflavonol
Intensitas berkurang dengan bertambahnya waktu
Gugus yang peka terhadap basa, -OH
pada 6,7 atau 7,8
Calkon Auron
Pergeseran batokromik atau bahu pada panjang gelombang yang
lebih panjang 4’ dan atau 4-OH
calkon 4’ dan atau 6-OH
auron
Tabel VI. Penafsiran spektra UV dengan penambahan NaOAcH
3
BO
3
Markham,1988.
Pergeseran panjang gelombang puncak
Jenis flavonoid I II
Petunjuk penafsiran
+ 12-36nm nisbi terhadap spektrum
MeOH o
-diOH pada cincin B
Flavon Flavonol
Pergeseran lebih kecil
o -diOH pada
cincin A 6,7 atau 7,8
Isoflavon Flavonon
Dihidroflavonol + 10-15nm nisbi
terhadap spektrum MeOH
o -diOH pada
cincin A 6,7 atau 7,8
Auron Calkon
Pergeseran lebih kecil
o -diOH pada
cincin A 6,7 atau 7,8
27
Tabel VII. Penafsiran spektra UV dengan penambahan AlCl
3
dan AlCl
3
HCl Markham, 1988.
Pergeseran yang tampak Jenis flavonoid
I II Petunjuk penafsiran
+ 35-55nm + 17-20nm
Tak berubah 5-OH
5-OH dengan oksigenasi pada 6
Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6
+ 50-60nm Mungkin 3-OH dengan
atau tanpa 5-OH Pergeseran
AlCl
3
HCl + 30-40nm
o -diOH pada cincin B
Flavon Flavonol
AlCl
3
HCl
Pergeseran AlCl
3
HCl + 20-25nm
o -diOH pada cincin A
tambahan pada pergeseran o-diOH pada
cincin B
Isoflavon Flavanon
Dihidroflavonol AlCl
3
HCl +
10-14nm + 20-26nm
5-OH isoflavon 5-OH flavanon,
dihidroflavonol
Pergeseran AlCl
3
HCl + 11-30nm
o -diOH pada cincin A
6,7 dan 7,8 AlCl
3
Pergeseran AlCl
3
HCl + 30-38nm peka
terhadap NaOAc
Dihidroflavonol tanpa 5- OH tambahan pada
sembarang pergeseran o- diOH
Auron Khalkon
AlCl
3
HCl + 48-64nm
+ 40 nm 2’-OH
khalkon 2’-OH khalkon dengan
oksigenasi pada 3’ AlCl
3
+ 60-70nm
Pergeseran AlCl
3
HCl + 40-70nm
Penambahan lebih kecil
4-OH auron
o -diOH pada cincin B
mungkin o-diOH pada cincin A
+ 25-35nm pada pH 2-4
o -diOH
Antosianidin Antosianin
AlCl
3
Pergeseran lebih besar
Banyak o-diOH atau o- diOH 3-deoksi
antosianidin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian non eksperimental dan bersifat deskriptif komparatif yang dilakukan di laboratorium Farmakognosi Fitokimia,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Bahan Penelitian
1. Bahan tanaman
Buah makuta dewa diperoleh dari daerah Samigaluh, Kulon Progo, Yogyakarta. Diambil buahnya yang benar-benar segar tidak busuk dan telah
masak, dengan spesifikasi kulit buah bersih, agak benjol-benjol, berwarna merah maron, dan daging buah terasa agak lunak bila ditekan.
2. Bahan kimia
Semua bahan kima yang digunakan dalam penelitian berderajat pro analis p.a produksi MERCK kecuali aqua destilata. Bahan-bahan tersebut
adalah metanol, asam asetat, amonia, t-butanol, kloroform, dietil eter, natrium hidroksida, natrium asetat, aluminium klorida dan asam klorida.
3. Bahan untuk kromatografi kertas
Bahan untuk identifikasi senyawa flavanoid dengan KKt adalah kertas Whatmann no 1.
28 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
C. Alat
a. Alat penyarian: alat-alat gelas, alat parut, kain saring, timbangan elektrik
Mettler Toledo, Switzerland, penangas air. b.
Alat kromatografi dan spektroskopi: bejana kromatografi, lampu UV 366 nm, pipa kapiler 5 mikroliter, spektrofotometer UV Thermo Spectronic Genesys 6
tipe split beam.
D. Rancangan Penelitian
Langkah-langkah dalam penelitian meliputi : 1.
Determinasi Determinasi tanaman makuta dewa mengacu pada pustaka.
2. Pembuatan perasan daging buah makuta dewa
Buah makuta dewa masak yang masih segar dicuci dengan air sampai bersih, dibuang bijinya, kemudian diparut bersama kulitnya. Hasil parutan
diperas dengan bantuan kain saring sampai seluruh sari buah makuta dewa terperas habis.
3. Reaksi warna untuk flavonoid
Perasan daging buah makuta dewa diuji menggunakan pereaksi : tiga tetes larutan pada drop plate ditambah 1 tetes larutan AlCl
3,
tiga tetes larutan pada drop plate tambah 1 tetes larutan NaOH 1, dan tiga tetes larutan pada
drop plate ditambah 2 tetes HCI pekat dan serbuk Mg. Adanya perubahan warna dicatat untuk memperkirakan golongan
flavonoidnya. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
4. Identifikasi Pendahuluan dengan Kromatografi Kertas Satu Arah KKt 1A
Sebanyak 10 ml perasan daging buah makuta dewa ditambah 10 ml kloroform, fase kloroform dibuang ulangi sampai 3 kali. Untuk fase air
ditambali eter 10 ml lalu dipisahkan. Hasil yang didapatkan berupa fraksi eter sampel 2 dan fraksi air sampel 3. Masing-masing fraksi diuapkan hingga
tinggal sedikit. Selanjutnya masing-masing fraksi ditotolkan pada kertas Whatman no 1 dengan menggunakan pipa kapiler ukuran 5 µi dan dielusi
dengan t-butanol asam asetat : air TBA 3:1:1. Setelah terelusi pada batas yang ditentukan lalu diangkat, keringkan. Catat adanya warna bercak di bawah
penyinaran UV 366 nm sebelum dan sesudah diuapi dengan amonia. 5.
Kromatografi Kertas Dua Dimensi KKt 2A Dalam kromatografi ini digunakan kertas Whatman no 1 ukuran 20 x
20 cm. Dimana larutan perasan daging buah makuta dewa dalam larutan eter ditotolkan pada pojok kanan bawah kertas dengan jarak 1 cm dari tepi dan
dasar kertas. Penotolan dilakukan dengan mikro pipet. Pengembangan tahap pertama digunakan t-butanol asam asetat : air TBA 3:1:1. Setelah terelusi
pada batas yang ditentukan lalu kertas diangin-anginkan hingga kering. Selanjutnya dilakukan pengembangan tahap kedua. Pada pengembangan tahap
kedua digunakan asam asetat 15. Setelah terelusi pada batas yang ditentukan kertas diambil dan diangin-anginkan hingga kering. Adanya bercak
kromatogram yang terjadi di amati dibawah sinar UV 366 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia. Harga Rf dicatat pada masing-masing bercak untuk
tiap tahap pengembang. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Hasil dan KKt 2A ini dapat juga digunakan unluk mengisolasi flavonoid dengan cara bercak yang sesuai digunting dari kromatogram, lalu
bercak yang sama digabungkan dan setelah digunting menjadi potongan kecil- kecil diekstraksi dengan pelarut yang sesuai digunakan metanol MeOH.
Bila diperlukan, hasil pemisahan KKt 1A dapat digabungkan dengan hasil pemisahan KKt 2A hasil replikasi agar diperoleh flavonoid murni Markham,
1988. 6.
Identifikasi Isolat Flavonoid dengan Spektrofotometri UV Isolat diperoleh dari pemotongan masrng-masing bercak pada kertas
Kategori