3.3 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan April hingga November di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.4 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan pemeriksaan bentuk, ukuran, warna, bau dan rasapada rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner
C.Agard.
3.5 Pembuatan Pereaksi
Proses pembuatan pereaksi meliputi pereaksi asam klorida 1 N dan perekasi asam klorida 0,1 N.
3.5.1 Pereaksi asam klorida 1 N
Sebanyak 85 ml asam klorida pekat cukupkan dengan air hingga 1000 ml Ditjen POM RI., 1995.
3.5.2 Pereaksi asam klorida 0,1 N
Diencerkan 8,5 ml asam klorida pro analis dicampurkan dengan akuades dan dicukupkan hingga 1000 ml Ditjen POM RI., 1995.
3.6 Isolasi Senyawa Fukoidan
Timbang 50 g serbuk rumput laut coklat, dimasukkan kedalam gelas beker 1000 ml. Selanjutnya diekstraksi dengan 500 ml larutan asam klorida 0,1 N pada
Universitas Sumatera Utara
suhu 100
o
C selama 4 jam sambil dilakukan pengadukan setiap 10 menit. Disaring dengan menggunakan kain flanel lalu diperas, diperoleh filtrat.Filtrat yang
diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan dipisahkan dari filtrat dengan cara enap tuang. Selanjutnya filtrat ditambah etanol
96 dengan perbandingan 1:1 hingga terbentuk endapan, dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan dikumpulkan di
atas kaca arloji dan dikeringkan di dalam oven pada suhu 50
o
C Junaidi, et al., 2009.Bagan kerja prosedur isolasi senyawa fukoidan dapat dilihat pada Lampiran
3, halaman 43.
3.7 Penetapan Susut Pengeringan
Sebanyak 1 g serbuk isolatfukoidan ditimbang dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang telah dipanaskan pada suhu 105
o
C selama 30 menit dan telah ditara.Serbuk diratakan dalam botol timbang dengan
menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal 5-10 mm. Kemudian dimasukkan ke dalam oven, tutupnya dibuka dan dikeringkan pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap.Sebelum setiap pengeringan, dibiarkan botol dalam
keadaantertutup dingin dalam desikator hingga suhu kamar. Susut pengeringan dihitungterhadap bahan awal Ditjen POM RI, 1995.
3.8 Identifikasi Senyawa Fukoidan
Identifikasi isolat senyawa fukoidan rumput laut coklat meliputi analisis senyawa fukoidan secara spektrofotometri UV dan spektrofotometri FTIR.
Universitas Sumatera Utara
3.8.1 Analisis secara spektrofotometri UV
Senyawa fukoidan hasil isolasi diidentifikasi secara spektrofotometri UV. Prosedur kerja dilakukan dengan menimbang 20 mg senyawa isolat fukoidan,
dilarutkan dengan asam klorida 0,1 N dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml, lalu dicukupkan hingga garis tanda. Diukur serapannya pada bilangan gelombang
200-400 nm. Kemudian dibandingkan dengan senyawa baku fukoidan.
3.8.2 Analisis secara spektrofotometri FTIR
Isolat fukoidan diidentifikasi secara spektrofotometri FTIR. Prosedur kerja dilakukan dengan cara mencampurkan 1 mg serbuk isolat fukoidan dengan 10 mg
KBr digerus di dalam mortar, ditekan hingga diperoleh pelet kemudian dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer FTIR,diukur serapannya pada
bilangan gelombang 4000-400 cm
-1
.Kemudian dibandingkan dengan senyawa baku fukoidan.
3.9 Pengujian Sitotoksik
Pengujian dilakukan terhadap fukoidan hasil isolasi dari talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C.Agard menggunakan larva Artemia salina
Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test.
3.9.1 Pembuatan air laut buatan
Bahan yang digunakan dalam pembuatan air laut buatan adalah garam laut tanpa yodium sebanyak 38 gram dalam 1000 ml air suling Sahgal, et al., 2010.
Dilarutkan garam laut tanpa yodium dalam beker gelas sampai terlarut sempurna kemudian di masukkan ke dalam labu tentukur 1000 ml dan ditambahkan air
suling sampai 1000 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.9.2 Penetasan telur Artemia salina Leach
Disiapkan bejana penetasan yang mempunyai dua bagian bersekat.Sekat dalam wadah tersebut di lubangi agar larva dapat berpindah dari tempat yang
gelap ke tempat yang terang.Masukkan air laut buatan kedalam bejana.Telur Artemia salinaLeach ditaburkan secara berhati-hati Indiastuti, et al., 2008.
Bagian wadah yang berisi telur tersebut ditutup dengan aluminium foilsedangkan bagian wadah yang tidak ditempati telur diterangi dengan sinar lampu 14 watt
untuk menghangatkan suhu dalam penetasan. Setelah 48 jam, diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet tetes Juniarti dan Yuhemita, 2009.
3.9.3 Pengujian brine shrimp lethality test
Disiapkan larutan uji yang terdiri dari isolat senyawa fukoidan dengan konsentrasi: 1000, 100, dan 10 µgml, disiapkan 3 vial untuk masing-masing
konsentrasi larutan uji sehingga semuanya menjadi 9 vial dan 1 vial untuk kontrol. Larutan induk I dibuat dengan menimbang 50 mg isolat lalu dilarutkan dengan air
suling sampai 5 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 µgml. Dipipet 0,5 ml larutan induk I lalu diencerkan sampai 5 ml sehingga diperoleh larutan induk II
dengan konsentrasi 1000 µgml. Dipipet 0,5 ml larutan induk IIlalu diencerkan sampai 5 ml sehingga diperoleh konsentrasi 100 µgml. Dipipet 0,5 ml dari larutan
konsentrasi 100 µgml lalu diencerkan sampai 5 ml sehigga diperoleh konsentrasi 10 µgml. Dimasukkan larutan uji ke masing-masing vial. Dimasukkan sedikit air
laut buatan ke dalam masing-masing vial.Dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina Leach, lalu ditambahkan air laut buatan sampai 5 ml. Kemudian semua vial
diletakkan di bawah cahaya lampu. Setelah 24 jam dihitung jumlah larva yang mati Mclaughlin dan Lingling, 1988. Selain itu, pembuatan kontrol pada air laut
Universitas Sumatera Utara
y = a + bx
100 x
uji larva
jumlah mati
larva Jumlah
kematian =
juga telah dilakukan. Dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina Leach ke dalam vial dan dicukupkan sampai 5 ml air laut buatan tanpa penambahan isolat. Data
dianalisis dengan metode analisis probit untuk menentukan LC
50
.Bagan uji sitotoksik dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 44.
3.10 PerhitunganLC
Uji sitotoksik dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test menggunakan larva Artemia salina Leach terhadap larutan isolat fukoidan
sehingga diperoleh suatu data yang kemudian diolah dengan menggunakan model analisis probit untuk menentukan nilai LC
50
Pengukuran dilakukan dengan menghitung jumlah Artemia salina Leach yang mati sebanyak 50 dari total larva uji 10 ekor pada vial. Kemudian nilai
LC
50.
50
a. Rumus persen kematian dihitung dengan memasukkan angka probit 50 kematian larva uji.Efek
sitotoksik dihitung dari persen kematian larva Artemia salina Leach dan persamaan regresi linear Rahma, et al., 2013.
b. Persamaan regresi linier. Keterangan:
y = Nilai probit x = log konsentrasi
a = Intercept garis potong b = Slope kemiringan dari garis regresi linier
Universitas Sumatera Utara
x100 10
K -
T kematian
=
LC
50
adalah nilai antilog x yang saat y = 50. Apabila pada kontrol ada larva yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot:
Keterangan : T = jumlah larva uji yang mati
K = jumlah larva kontrol yang mati 10 = jumlah larva uji
Perhitungan LC
50
fukoidan hasil isolasi dari talus rumputSargassum ilicifolium Turner C. Agard dapat dilihat pada lampiran 11, halaman 56.
3.11Analisis Data Sitotoksik
Ada banyak cara untuk menentukan nilai LC
50
. Salah satu cara yaitu dengan metode probit. Untuk menghitung LC
50
berdasarkan metode probit, berikut merupakan langkah pembuatan perhitungan LC
50
1. Mempunyai tabel probit
, yaitu :
2. Menentukan nilai probit dari kematian tiap kelompok hewan uji
3. Menentukan log dosis tiap-tiap kelompok
4. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log
dosis, y = a+bx 5.
Masukkan nilai 5 probit 50 kematian hewan coba pada persamaan garis lurus, pada nilai y. Nilai LC
50
Ekstrak dikatakan bersifat toksis jika harga LC dihitung dari nilai antilog x pada saat y = 5.
50
1000 ppm, sedangkan untuk senyawa murni jika LC
50
200 ppm berpotensi antikanker Meyer, et al., 1982.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI, Jakarta, Indonesia adalah rumput
laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C.Agard, suku Sargassaceae. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 41.
4.2 Hasil Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan karakterisasi rumput laut Sargassum ilicifolium Turner C. Agard secara makroskopik dilakukan untuk memperoleh identitas simplisia.Hasil
pemeriksaan makroskopik rumput laut coklatyaitu rumput laut coklat memiliki warna coklat, mempunyai bau khas, daun berbentuk lonjong kecil dengan
tepibergerigi, dan batang kecil berwarna coklat.Hasil pemeriksaan makroskopik yang dilakukan terhadap simplisia rumput laut coklat yaitu simplisia berwarna
coklat tua.Hasil pemeriksaan makroskopik rumput laut coklat dapat dilihat padaLampiran 5, halaman 45.
4.3Hasil Isolasi Senyawa Fukoidan
Isolasi senyawa fukoidan dari 550 g simplisia rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C.Agardmemperoleh isolat sebanyak 19,86 g
Rendemen 3,61. Fukoidan yang diperoleh berwarna coklat tua dan berbau khas.Perhitungan persen rendemen fukoidan pada Lampiran 8, halaman 51.
Universitas Sumatera Utara
Kategori