Pemotongan Imunoglobulin G AI H5N1 dan Pemurnian Fragmen Fab

akan menyebabkan molekul-molekul garam keluar melalui pori-pori tabung secara bertahap hingga konsentrasi garam di dalam dan di luar tabung dialisis menjadi sama. Fragmen Fab 2 hasil pemurnian ini kemudian di analisa profil pita proteinnya menggunakan Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS- PAGE dan diukur konsentrasinya dengan spektrofotometer ultraviolet. Profil pita protein Imunoglobulin G dan fragmen Fab 2 dapat dilihat pada Gambar 14 dan 15. Imunoglobulin G mempunyai berat molekul 150 kDa dan fragmen Fab 2 mempunyai berat molekul 110 kDa. Pengukuran konsentrasi fragmen Fab 2 dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet diperoleh hasil sebesar 1 mgml. Jumlah ini cukup untuk digunakan sebagai antigen, guna menginduksi terbentuknya antibodi anti-idiotipe pada kelinci. Dosis antigen berkisar antara 10-100 µg Leenars et al. 1997; Paryati 2006; Poetri et al. 2008. Secara in vivo dengan 100 µg fragmen Fab 2 dapat mencegah virus AI H5N1 Lu et al. 2006, namun untuk antigen protein dianjurkan memakai dosis antara 50-1000 µg Leenars et al. 1994. M 1 2 3 4 5 220 100 60 50 40 30 25 20 15 10 M 1 2 225 150 100 75 50 35 25 15 10 Gambar 14 Profil pita protein Imunoglobulin G yang telah dipurifikasi: M. Marker Invitrogen; 1. IgG Ab 1 ; 2. IgG kelinci kontrol; 3. IgG Ab 2 ; 4. IgG Ab 2 ; 5. IgG kelinci standar Promega Gambar 15 Profil pita protein Fragmen Fab 2 : M. Marker Promega; 1. Fab 2 ; 2. Fab 2 dan Fc Fragmen Fab 2 adalah antibodi AI H5N1 Ab 1 dan digunakan untuk mengimunisasi kelinci untuk produksi antibodi anti-idiotipe Ab 2 . Fragmen Fab 2 ini mampu mengikat antigen seperti antibodi asal dan masih bersifat divalen. Fragmen ini masih dapat mempresipitasikan antigen karena masih mempunyai kedua binding site tempat ikatan Roitt 2003 Menurut Rantam 2003, SDS-PAGE adalah protein dielektrophoresis dalam detergen ionik yaitu SDS. Detergen ini akan mengikat residu hidrophobik dari bagian belakang peptida secara komplit, dengan demikian protein SDS-komplek migrasi melalui poliakrilamid tergantung dari berat molekulnya. Ada dua sistem pada SDS yaitu kontinyu Weber Osbon dan diskontinyu Laemli. Sistem kontinyu, campuran protein dilapiskan pada bagian atas bands pada bagian atas dari separating gel, sehingga kelemahan pada sistem ini akan terjadi resolusi dengan sampel. Penelitian ini menggunakan sistem diskontinyu, dimana protein migrasi dengan cepat melaui pelarut ion pada stacking gel dan separating gel. Protein terkonsentrasi pada garis tipis berupa pita atau band yang tipis. Lebih lanjut Rantam 2003 menyatakan bahwa Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE adalah merupakan standar metode pengujian terhadap berat molekul protein, struktur subunit dan kemurnian protein. Poliakrilamid adalah matrix pilihan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul antara 500-250.000 Dalton. Pori-pori pada matrik dibentuk oleh rantai cross-linking linear polyacrylamid dengan bis acrylamide. Ukuran pori-pori berkurang sesuai dengan peningkatan total presentasi acrylamide atau peningkatan derajat presentasi konsentrasi campuran dengan bisacrylamide . Dengan pembuatan atau pemilihan total konsentrasi yang tepat akan menentukan pula ukuran yang tepat terhadap ukuran protein yang diinginkan. Jadi semakin tinggi total presentasi akan menghalangi pergerakan protein ke dalam gel, begitu juga bila terlalu rendah total presentasi akan mengakibatkan pergerakan protein menjadi terlalu cepat bergerak melalui gel yang mengakibatkan didapatkan protein spesifik rendah dan tidak sesuai dengan protein yang diinginkan. Awal terjadinyapolimerasi biasanya disempurnakan oleh ammonium persulfat dan dikatalisa oleh N,N,N,N- Tetramethylethylenediamine TEMED. Antibodi Ab 1 murni satu spesies yang disuntikkan ke spesies yang berbeda akan dikenali sebagai antigen asing dan menimbulkan respon humoral Ab 2 yang kuat Harlow Lane 1988; Roitt 2003. Penggunaan fragmen Fab 2 dari antibodi sebagai Ab 1 dapat meningkatkan spesifisitas dan mengurangi heterogenitas antibodi yang akan terbentuk dari hasil imunisasi menggunakan Ab 1 sebagai antigen. Imunisasi dengan fragmen Fab IgG menunjukkan respon yang lebih besar dibandingkan imunisasi dengan IgG yang disebabkan sifat menghambat bagian Fc Roitt 2003.

4.3 Produksi Antibodi Anti-Idiotipe Ab

2 Pada Kelinci Fragmen Fab 2 dari marmut atau disebut juga Ab 1 digunakan untuk menginduksi antibodi anti-idiotipe Ab 2 . Fragmen ini diemulsikan dengan menggunakan FCA yaitu Freund’s adjuvant bentuk lengkap dan diimunisasikan pada kelinci. Dua ekor kelinci di imunisasi dengan Ab 1 , dan satu ekor kelinci sebagai kontrol. Satu minggu kemudian fragmen Fab 2 diemulsikan dengan FIA yaitu Freund’s adjuvant bentuk tidak lengkap. Serum kelinci diperiksa keberadaan antibodi terhadap Ab 1 dengan uji AGP . Akibat rangsangan antibodi Ab 1 akan terbentuk antibodi dengan urutan asam amino khas yang diekspresikan sebagai epitop unik pada regio variabel molekul antibodi Ab 2 . Idiotipe pada Ab 2 digunakan sebagai dasar pembuatan vaksin yang potensial untuk melawan agen infeksius Kennedy Attanasio 1990. Identifikasi serum kelinci dengan uji AGP menunjukkan terbentuknya garis presipitasi antara Ab 1 dengan serum kelinci, hasil ini menunjukkan bahwa Ab 2 memiliki kemiripan antigenic determinant dengan virus AI yang digunakan sebagai master seed vaksin. Antibodi anti-idiotipe ini selanjutnya dimurnikan IgG-nya

4.3.1 Pemurnian Imunoglobulin G Antibodi Anti-idiotipe Ab

2 Pemurnian IgG kelinci dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody Purification Kit Spin Column with Procep A Millipore. Pemurnian dilakukan untuk mendapatkan IgG murni. Imunoglobulin G kelinci adalah antibodi anti-idiotipe Ab 2 yang merupakan antibodi poliklonal yang mengandung antibodi dengan spesifisitas, afinitas dan isotipe yang berbeda. Antibodi poliklonal relatif stabil dan bereaksi dengan sejumlah antigen determinan yang berbeda, sehingga mengakibatkan terbentuknya komplek antigen-antibodi yang lebih besar dan mudah mempresipitasikan antigen. Karakterisasi antibodi anti-idiotipe Ab 2 dilakukan dengan mengukur berat molekul dengan SDS-PAGE. Imunoglobulin G kelinci mempunyai berat molekul 150 kDa Gambar 15.

4.3.2 Reidentifikasi Antibodi Anti-idiotipe Ab

2 Hasil pemurnian Ig G kelinci selanjutnya diidentifikasi dengan uji AGP. Identifikasi menunjukkan reaksi positif yang ditandai dengan terbentuknya garis presipitasi antara Ab 1 dan Ab 2 , artinya telah terbentuk antibodi terhadap Ab 1 Gambar 16 . Gambar 16 Antibodi Anti-idiotipe Sebagai Imunogen: Ab 1 . Antibodi AI H5N1; Ab 2. Antibodi anti-idiotipe; → garis presipitasi Adanya garis presipitasi merupakan adanya reaksi homolog antara Ab 1 dan Ab 2 . Daerah variabel suatu antibodi yang mengikat antigen bersifat antigenik dan dapat menstimulasi terbentuknya antibodi terhadap daerah variabel itu sendiri jika disuntikkan Ab 1 Ab 2 Ab 2 Ab 2 Ab 2 Ab 2 Ab 2