media Millipore. Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian
dimasukkan kedalam spin colomn. Spin column dicuci dengan 10 ml binding buffer, kemudian disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum marmut di saring
dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 µm, selanjutnya sampel serum dilarutkan dengan binding buffer dengan perbandingan 1:1 vv, lalu dimasukkan kedalam spin
column dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Spin colomn dicuci
kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml
buffer dan elusi dilakukan langsung kedalam tabung sentrifus yang berisi 1,3 ml buffer netral, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada
dibawah ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30
menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG poliklonal. Reidentifikasi IgG AI H5N1 dilakukan dengan uji AGP dan untuk mengetahui berat
molekul IgG dilakukan SDS-PAGE Hames Rickwood 1987 dengan menggunakan sistem diskontinyu. Sistem ini terdiri atas gel pemisah dengan konsentrasi 12 dan gel
pengumpul dengan konsentrasi 4 . Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi berat molekul protein berdasarkan perbandingan dengan marker umum berat molekul,
selanjutnya konsentrasi IgG dihitung dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet. 3.3.2.3 Pemotongan Imunoglobulin G AI H5N1 dan Pemurnian Fragmen Fab
2
Pemotongan Imunoglobulin G IgG dari serum marmut ditujukan untuk memperoleh fragmen Fab
2
dari imunoglobulin. Fragmen Fab
2
, selanjutnya disebut Ab
1
, akan digunakan untuk merangsang terbentuknya antibodi spesifik terhadap epitop
Ab
1
pada kelinci. Antibodi yang akan terbentuk oleh Ab
1
ini merupakan antibodi anti- idiotipe Ab
2
. Pemotongan dilakukan dengan menggunakan enzim pepsin, sehingga akan diperoleh 1 fragmen Fab
2
divalen yang mengandung 2 Fab dan 1 fragmen Fc. Imunoglobulin G dibuat menjadi 5 mgml dalam Na sitrat 100 mM pH 3.5.
Pemotongan IgG dilakukan dengan menggunakan 5 µg pepsin untuk 1 mg IgG, kemudian diinkubasi dalam penangas air pada suhu 37
C selama 24 jam, setelah 24 jam reaksi pemotongan dihentikan dengan Tris buffer 3 M pH 8,8 sebanyak 10, lalu disentrifus
dengan kecepatan 10.000 g selama 30 menit. Larutan ini kemudian di desalting dengan Amicon Ultra 15
dengan kecepatan 4500 g selama 20 menit. Larutan ini kemudian di dialisis dalam PBS pH 8.0 selama 24 jam untuk menghilangkan garam yang terdapat
pada larutan protein. Proses dialisis ini akan menyebabkan molekul-molekul garam keluar melalui pori-pori tabung secara bertahap hingga konsentrasi garam di dalam dan di
luar tabung dialisis menjadi sama. Hasil dialisis inilah yang akan digunakan sebagai Ab
1
untuk mengimunisasi kelinci. Reidentifikasi dilakukan dengan metode SDS-PAGE. Fragmen Fab
2
memiliki berat molekul 110 kDa, selanjutnya konsentrasi ditentukan dengan menggunakan
spektrofotometer ultra violet.
3.3.3 Produksi Antibodi Anti-Idiotipe Ab
2
Pada Kelinci
Antibodi anti-idiotipe Ab
2
disiapkan dengan cara menyuntik kelinci dengan Ab
1
Fab
2
. Produksi Ig G menggunakan 3 ekor kelinci New Zealand White berat 2.5 kg. Dua ekor kelinci diimunisasi dengan 500 µg Ab
1
H5N1 dalam Freund’s Complete Adjuvant
FCA secara subcutan dan satu ekor kelinci sebagai kontrol. Imunisasi ulangan dilakukan satu minggu berikutnya dengan menyuntikkan 500 µg Ab
1
dalam Freund’s Incomplete Adjuvant
FIA secara subcutan. Satu minggu kemudian serum dikoleksi dan identifikasi keberadaan Ab
2
H5N1 strain Legok dengan uji AGP. Berat molekul ditentukan dengan metode SDS-PAGE dan konsentrasinya dihitung dengan
spektofotometer ultra violet.
3.3.3.1 Pemurnian Imunoglobulin G Kelinci Anti-Idiotipe Ab
2
Pemurnian Imunoglobulin G IgG AI H5N1 dari serum kelinci Ab
2
dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit spin column with Prosep A
media Millipore. Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian
dimasukkan kedalam spin column. Spin column dicuci dengan 10 ml binding buffer, kemudian disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum marmut di saring
dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 µm, selanjutnya sampel serum dilarutkan
dengan binding buffer dengan perbandingan 1:1 vv, lalu dimasukkan kedalam spin column
dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Spin column dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5
menit, pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer dan elusi dilakukan langsung kedalam tabung sentrifus yang berisi 1.3 ml buffer
netral, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada dibawah ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan
menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG.
Reidentifikasi IgG kelinci dilakukan dengan uji AGP dan untuk mengetahui berat molekul IgG dilakukan SDS-PAGE Hames Rickwood 1987 dengan menggunakan
sistem diskontinyu. Sistem ini terdiri atas gel pemisah dengan konsentrasi 12 dan gel pengumpul dengan konsentrasi 4 . Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi
berat molekul protein berdasarkan perbandingan dengan marker umum berat molekul, selanjutnya konsentrasi IgG dihitung dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet.
3.3.4 Imunogenesitas “Kandidat Vaksin” Antibodi Anti-idiotipe
Imunisasi Antibodi Anti-idiotipe Ab
2
pada ayam dilakukan untuk mendeteksi terbentuknya antibodi terhadap Ab
2
. Antibodi yang diperoleh dari serum ayam merupakan antibodi anti anti-idiotipe Ab
3
. Antibodi ini diharapkan mempunyai karakteristik serologi sama dengan antibodi dari serum marmut Ab
1
, sehingga mampu bereaksi homolog dengan Ab
2
maupun dengan antigen virus AI. Imunisasi dilakukan sebagai berikut: sebanyak 20 ekor ayam dibagi 5 ekor
menjadi 4 kelompok, yaitu kelompok I sebagai kontrol; kelompok II sebagai kelompok Ig G kelinci kontrol, kelompok III sebagai kelompok kandidat vaksin antibodi anti-
idiotipe dan kelompok IV sebagai kelompok vaksin AI H5N1. Kelompok kontrol adalah kelompok ayam yang tidak diberi perlakuan. Kelompok Ig G kelinci kontrol
adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 500 µg Ig G kelinci kontrol dalam FCA secara intramuscular. Kelompok antibodi anti-idiotipe adalah kelompok ayam yang
diimunisasi dengan 500 µg Ab
2
dalam FCA secara intramuscular. Kelompok vaksin AI H5N1 adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 1 dosis vaksin komersil AI H5N1
