3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun Tumbuhan Mahkota Dewa yang diperoleh dariJl. Bioteknologi, FMIPA kampus USU Padang Bulan, Medan. Daun Tumbuhan
Mahkota Dewa dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun Mahkota Dewa sebanyak 1000 gram.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Mahkota Dewa
Serbuk daun Tumbuhan Mahkota Dewa diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia
2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun Tumbuhan Mahkota Dewa maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut:
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun Tumbuhan Mahkota Dewa ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan etil asetat ± 100 mL - Didiamkan
- Disaring - Dipekatkan dengan rotarievaporator
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi:
a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II
: dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda c. Tabung III
: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d. Tabung IV
: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak etil asetat dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Fasa gerak yang
digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10
v v ⁄
, 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄
dan 60:40
v v ⁄
.
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10
v v ⁄
kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak etil asetat pada batas
bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi sampai fasa gerak
mencapai batas atas. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk fasa gerak
n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄
dan 60:40
v v ⁄
.
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Mahkota Dewa
Serbuk daun tumbuhan mahkota dewa ditimbang sebanyak 1000 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ±4 L sampai semua sampel terendam dan
dibiarkan selama 24 jam dan diulangi sebanyak 3 kali. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak
pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat,
dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi
berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh
ekstrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2 N. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform
Universitas Sumatera Utara
secara berulang-ulang. Ekstrak kloroform dipekatkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 3,28 gram.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh
ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 vv.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan
3,28 g ekstrak pekat kloroform ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv secara
perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama
banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20vv ,
70:30vv dan 60:40vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan
FeCl
3
5. Kemudian diuapkan pelarutnya.
3.3.5. Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif