Alat-alat Bahan-bahan Bagan Skrining Fitokimia Bagan Penelitian

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Alat-alat

1. Alat Destilasi 2. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 3. Bejana Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 4. Botol Vial 5. Bunsen 6. Corong Kaca Pyrex 7. Corong Pisah 500 mL Pyrex 8. Ekstraktor 5000 mL Schoot Duran 9. Gelas Beaker 250 mL 1000 mL Pyrex 10. Gelas Erlenmeyer 500 mL 100 mL Pyrex 11. Gelas Ukur 100 mL 10 mL Pyrex 12. Kolom Kromatografi Pyrex 13. Labu Didih 1000 mL Schoot Duran 14. Labu Rotarievaporator 1000 mL Duran 15. Labu Takar 250 mL Pyrex 16. Lampu UV 254 nm 356 nm UVGL 58 17. Neraca Analitis Mettler AE 200 18. Penangas Air 19. Pipa Kapiler 20. Pipet Tetes 21. Rotarievaporator Bűchi R-114 22. Spatula 23. Statif dan Klem Universitas Sumatera Utara 24. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 25. Spektrofotometer UV-Visible 26. Spektrometer 1 H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz 27. Tabung Reaksi Pyrex

3.2 Bahan-bahan

1. Daun Tumbuhan Mahkota Dewa 2. Akuades 3. Benzena p. a. E. Merck 4. Eter p. a. E. Merck 5. Etil asetat Teknis 6. FeCl 3 5 7. HCl 2N 8. H 2 SO 4P 9. Kloroform Teknis 10. Metanol Teknis 11. Mg-HCl 12. NaOH 10 13. N-heksana Teknis 14. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA 15. Pereaksi Benedict 16. Plat KLT Merck Kieselgel 60 F 254 17. Plat KLT Preparatif Merck Kieselgel 60 F 254 Universitas Sumatera Utara

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun Tumbuhan Mahkota Dewa yang diperoleh dariJl. Bioteknologi, FMIPA kampus USU Padang Bulan, Medan. Daun Tumbuhan Mahkota Dewa dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun Mahkota Dewa sebanyak 1000 gram.

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Mahkota Dewa

Serbuk daun Tumbuhan Mahkota Dewa diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia 2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun Tumbuhan Mahkota Dewa maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut: - Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun Tumbuhan Mahkota Dewa ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan etil asetat ± 100 mL - Didiamkan - Disaring - Dipekatkan dengan rotarievaporator - Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi: a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda c. Tabung III : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d. Tabung IV : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan Universitas Sumatera Utara

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak etil asetat dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10 v v ⁄ , 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ dan 60:40 v v ⁄ . Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 v v ⁄ kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak etil asetat pada batas bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi sampai fasa gerak mencapai batas atas. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ dan 60:40 v v ⁄ .

3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Mahkota Dewa

Serbuk daun tumbuhan mahkota dewa ditimbang sebanyak 1000 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ±4 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam dan diulangi sebanyak 3 kali. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2 N. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform Universitas Sumatera Utara secara berulang-ulang. Ekstrak kloroform dipekatkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 3,28 gram.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 vv. Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 3,28 g ekstrak pekat kloroform ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20vv , 70:30vv dan 60:40vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian diuapkan pelarutnya.

3.3.5. Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pemurnian senyawa flvonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dilakukan karena hasil analis KLT dari kristal yang diperoleh dengan kromatografi kolom menunjukkan hasil yang belum murni. Fraksi yang digabung hasil kromatografi kolom dilarutkan dengan etil asetat kemudian dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah Universitas Sumatera Utara murni atau belum serta mencari fasa gerak yang sesuai untuk Kromatomatografi Lapis Tipis Preparatif. Fasa gerak yang menunjukkan pemisahan paling baik adalah chloroform : aseton 90:10 v v ⁄ dan selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Ekstrak etil asetat ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang batas bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Kemudian plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi fasa gerak yang telah dijenuhkan kemudian ditutup dan dielusi hingga fasa gerak mencapai batas atas plat. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Dimasukkan kembali plat KLT Preparatif yang telah ditotolkan kedalam chamber yang telah dijenuhkan. Kemudian ditutup dan dielusi hingga fase gerak mencapai batas atas plat. Setelah dielusi plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawh sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan digerus dari plat lalu dielusi dengan metanol :etil asetat 1:1 v v ⁄ . Hasil elusi diuapkan hingga terbentuk kristal.

3.3.6. Pemurnian dengan rekristalisasi

Kristal yang terbentuk hasil KLT Preparatif dilarutkan dengan etil asetat kemudian ditambahkan n-Heksan secukupnya. Kemudian didekantasi senyawa yang diinginkan dibiarkan sampai pelarut menguap hingga terbentuk Kristal kembali.

3.3.7. Uji kemurnian Hasil Isolasi

3.3.7.1. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis

Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 80:20 v v ⁄ , kloroform : metanol 80:20 v v ⁄ dan benzene : aseton 80:20 v v ⁄ . Dimasukkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 80:20 v v ⁄ dalam bejana kromatografi lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform pada batas bawah plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana Universitas Sumatera Utara kromatografi yang telah jenuh dan dielusi hingga fasa gerak mencapai batas atas plat. Lalu plat KLT yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana kromatografi, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna noda yang dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan pada fasa gerak kloroform : metanol 80:20 v v ⁄ dan benzene : aseton 80:20 v v ⁄ .

3.3.7.2.1. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati suhu ketika kristal melebur.

3.3.8. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer Ultraviolet-Visible UV-Vis

Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.

3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR

Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan KBr sebagai pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisa dengan alat spektrometer 1 H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.4. Bagan Skrining Fitokimia

10 gr Serbuk daun tumbuhan mahkota dewa Phaleria macrocarpa Scheff.Boerl. Diekstraksi maserasi dengan etil asetat Disaring Dipekatkan Dibagi kedalam 4 tabung reaksi Tabung I Tabung II Tabung III Tabung IV Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Larutan hitam Ditambahkan pereaksi NaOH 10 Diamati perubahan warna Larutan biru violet Ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p Diamati perubahan warna Larutan merah muda Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan orange kekuningan Universitas Sumatera Utara

3.5. Bagan Penelitian

1000 gram serbuk daun tumbuhan mahkota dewa Phaleria macrocarpa Scheff. Boerl. diskrining fitokimia dimaserasi dengan metanol selama ± 24 jam dilakukan sebanyak 3 kali disaring ekstrak metanol diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga semua metanol menguap ekstrak metanol pekat dilarutkan dengan etil asetat disaring diuapkan hingga semua etil asetat menguap dipekatkan dengan rotarievaporator diskrining fitokimia ekstrak etil asetat ekstrak pekat etil asetat diskrining fitokimia dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga pekat dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi benedict + dihidrolisis dengan HCL 6 sambil dipanaskan selama 60 menit didinginkan disaring lapisan metanol ekstrak metanol asam residu endapan hasil diskrining fitokimia lapisan n-heksana residu diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 4 kali lapisan kloroform lapisan metanol asam dipekatkan Universitas Sumatera Utara Sambungan Bagan Penelitian diskrining fitokimia di uji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada kolom dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak eluen n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 v v ditampung tiap fraksi sebanyak ± 13 mL dalam botol vial diuji kromatografi lapis tipis digabung fraksi dengan harga Rf yang sama fraksi 1-75 90:10 fraksi 76-168 80:20 fraksi 169-220 70:30 fraksi 221-262 70:30 fraksi 263-281 60:40 fraksi 282-302 60:40 diuji FeCl 3 5 hasil negatif diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 hasil positif hasil positif hasil positif hasil positif hasil positif diuji kromatografi lapis tipis dikromatografi lapis tipis preparatif dengan eluen kloroform:aseton 90:10 v v dikeringkan digerus dari plat dan dilarutkan dengan metanol:etil asetat 1:1 disaring senyawa murni diuapkan direkristalisasi diuji kromatografi lapis tipis diuji titik lebur dianalisis dengan Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah FT-IR, dan Spektrometer 1 H-NMR hasil analisa ekstrak pekat kloroform Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian