Hasil pada Tabel 4 menunjukkan bahwa fraksi 13 kromatografi gel filtrasi dengan nilai aktivitas penghambatan tertinggi terhadap RNA helikase HCV
memiliki konsentrasi gula sebesar 2,97 mgmL, sedangkan fraksi 10 kromatografi ion-exchange memiliki konsentrasi gula sebesar 3,21 mgmL. Hal ini
menunjukkan bahwa kandungan gula tidak selalu berkorelasi dengan aktivitas penghambatan dari polisakarida inhibitor, dikarenakan analisis hanya dilakukan
terhadap glukosa yang merupakan salah satu penyusun polisakarida. Sehingga dalam aktivitas menghambat RNA helikase HCV, tidak tertutup kemungkinan
bahwa glukosa berikatan dengan senyawa lain. Penelitian ini menggunakan metode fenol-asam sulfat. Dubois et al. 1956
menjelaskan bahwa prinsip metode fenol-asam sulfat adalah gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya, termasuk metil eter akan membentuk
warna kuning ketika direaksikan dengan fenol yang terkonsentrasi pada asam sulfat. Metode ini mengukur besarnya kandungan gula di dalam sampel, baik yang
dalam kondisi berikatan maupun senyawa bebas. Bennet dan Steitz 1978 menjelaskan bahwa senyawa glukosa dalam
keadaan terikatterkonjugasi dapat menghambat aktivitas ATPase dengan cara mengubah konformasi bentuk enzim heksokinase. Hal ini menunjukkan bahwa
senyawa glukosa juga dapat menghambat aktivitas ATPase dari enzim RNA helikase. Utama et al. 2000 menjelaskan bahwa enzim RNA helikase
memperoleh energi untuk membuka ikatan dupleks RNA virus hepatitis C dari aktivitasnya sebagai ATPase dalam menghidrolisis ATP menjadi ADP dan fosfat
anorganik Pi. Mukherjee et al. 2012 menyebutkan bahwa terdapat beberapa senyawa lain yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase HCV yaitu
triphenylmethane, acridone, amidinoanthracycline, tropolone, symmetrical benzimidazole, dan turunan senyawa primuline.
4.6 Analisis Kemurnian Fraksi Aktif Polisakarida Inhibitor
1 Kromatografi lapis tipis KLT Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk melihat profil kimiawi dari fraksi
13 kromatografi gel filtrasi yang memiliki aktivitas penghambatan paling besar terhadap RNA helikase. Hasil fraksi tersebut akan menunjukkan spot pemisahan
senyawa aktif pada plat KLT. Eluen fase gerak yang digunakan adalah asetonitril:metanol 6:4,sedangkan adsorben atau fase diam yang digunakan
adalah silika gel. Menurut Bintang 2010, silika gel umumnya digunakan pada KLT untuk memisahkan senyawa asam amino, alkaloid, gula, asam lemak, lipid,
minyak esensial, anion dan kation anorganik, steroid dan terpenoid. Tiap spot yang terdeteksi merupakan gambaran suatu senyawa. Hasil kromatogram dan
retardation factor Rf yang dihasilkan dapat dilihat padaGambar 19dan Tabel 5.
Gambar 19 Kromatogram KLT dengan deteksi sinar UV 254 nm.kiri: fraksi 13 kromatografi gel filtrasi, kanan: standar glukosa 1 mgmL.
Tabel 5 Nilai R
f
senyawa aktif polisakarida Sampel
R
f
Fraksi 13 kromatografi gel filtrasi Standar glukosa
0,832 0,834
Hasil KLT menunjukkan bahwa fraksi 13 mempunyai 1 spot dengan nilai R
f
sebesar 0,832. Nilai ini mendekati spot yang ditunjukkan oleh standar glukosa yang digunakan dengan nilai R
f
sebesar 0,834 sehingga diduga bahwa komponen aktif yang terdeteksi merupakan senyawa glukosa. Hasil penelitian lain yang
dilaporkan Biringanine et al. 2012 menunjukkan bahwa polisakarida inhibitor HCV dari tumbuhan Plantago palmata memiliki kandungan monosakarida jenis
ramnosa, arabinosa dan glukosa dengan nilai R
f
pada KLT sebesar 0,3; 0,5 dan 0,65. Perbedaan nilai R
f
dapat dipengaruhi oleh fase gerak yang digunakan. Soczewinski Wawrzynowics 2003 menjelaskan bahwa senyawa yang
berikatan lebih kuat dengan fase diam akan terpisah paling akhir dikarenakan daya serap adsorben dengan komponen-komponen senyawa tidak sama sehingga
senyawa tersebut akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya.
2 Kromatografi cair kinerja tinggi KCKTHPLC Fraksi dengan aktivitas tertinggi fraksi 13 dari hasil fraksinasi gel filtrasi
dianalisis kemurniannya menggunakan teknik kromatografi cair kinerja tinggi KCKTHPLC. Tingkat kemurnian akan terlihat dari banyaknya peak atau
puncak yang terdeteksi yang menunjukkan banyaknya senyawa yang terdeteksi dalam sampel. Tingkat kemurnian paling tinggi diperoleh jika hanya terdapat satu
peak yang terdeteksi. Kromatogram yang ditunjukkan oleh fraksi 13 dan hasil analisisnya dapat dilihat pada Gambar 20.
Gambar 20Kromatogram KCKT fraksi 13. Fraksi 13 memiliki tiga peak Gambar 19, satu peak tajam yang
menunjukkan retention time R
t
sebesar 4,072, dan dua peak lainnya yang terdeteksi dengan R
t
4,706 dan 5,530. Hal ini menunjukkan bahwa hasil fraksi aktif yang didapat tersebut belum murni karena masih terdapat senyawa lain.
Senyawa-senyawa yang terdeteksi diduga berperan dalam penghambatan aktivitas RNA helikase virus hepatitis C, namun belum diketahui aktivitas inhibisi dari
masing-masing senyawa tersebut. Mekanisme inhibitor RNA helikase meliputi 1 inhibitor menempel pada RNA helikase tidak pada sisi aktifnya, namun terjadi
perubahan konformasi bentuk enzim yang mengakibatkan berkurangnya interaksi enzim dengan substrat Borowski et al. 2008, 2 inhibitor berikatan pada sisi
aktif enzim RNA binding-site sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim,
menyebabkan enzim tidak memiliki cukup energi untuk membuka untai ganda RNA Yamashita et al. 2012.
16
5 SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
Enzim RNA helikase berhasil dipurifikasi dengan bobot molekul sebesar 54 kDa. Kultur mikroalga BTM 11 dapat tumbuh pada media IMK-Sea Water
dengan menghasilkan biomassa basah sebesar 338 g pada umur panen 14 hari. Polisakarida yang memiliki aktivitas inhibisi tertinggi terhadap RNA helikase
HCV diperoleh melalui pemurnian menggunakan kromatografi gel filtrasi, dengan aktivitas sebesar 78,76 dan kandungan gula sebesar 2,97 mgmL. Hasil
pemurnian lanjutan menggunakan kromatografi lapis tipis menghasilkan satu spot senyawa aktif dengan nilai R
f
sebesar 0,832. Hasil analisis fraksi aktif dengan menggunakan KCKT diperoleh 3 puncak senyawa yang menandakan bahwa hasil
fraksi polisakarida belum murni.
5.2 Saran
