Laboratorium Kelompok Penelitian Marikultur P2O-LIPI, media Walne Tabel 3, aseton, asam nitrat 10, akuades, air laut yang telah disaring dengan membran
filter 0. 45 μm dan disterilisasi dengan autoclav, larutan induk stock solution
kadmium CdCl
2
dan timbal PbNO
3 2
, serta larutan lugol sebagai bahan pengawet. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk ekstraksi perolehan konsentrasi
aktual adalah HNO
3
1N, NaOH 1N, APDC amonium pyrollidine dithiocarbamate 2, MIBK methyl isobutyl ketone, akuades dan HNO
3
pekat.
3.3 Metode Pelaksanaan
3.3.1 Pencucian dan Sterilisasi Peralatan
Pencucian peralatan disesuaikan dengan prosedur ASEAN Canada CPMS-
II 1995, sebagai berikut:
1. Peralatan dari bahan dasar kaca maupun plastik dicuci dengan detergen non fosfat teepol sampai bersih kemudian dibilas dengan air ledeng.
2. Peralatan dari bahan dasar kaca maupun plastik dicuci dengan HNO
3
10 untuk menghilangkan logam berat yang masih ada, kemudian dibilas
dengan akuades 3 kali. 3. Peralatan gelas dicuci dengan aseton pekat untuk menghilangkan bahan
organik yang masih ada, kemudian dibilas dengan akuades 3 kali. Erlenmeyer yang telah dicuci ditutup dengan alumunium foil, kemudian
disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121
o
C dalam waktu 15 menit. Setelah itu dikeringkan dengan menggunakan oven selama 1 jam.
3.3.2 Kultur C. gracilis dan Pemeliharaannya
Pemeliharaan kultur C. gracilis dimulai dengan pembuatan media Walne sebagai media kultur. Pembuatan Walne meliputi penambahan trace metal,
vitamin dan nutrien ke dalam air laut yang steril. Susunan dari komponen media Walne ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Komposisi bahan-bahan media Walne bagi pemeliharaan C. gracilis Asean Canada CPMS-II,1995
Komponen Komposisi
Jumlah terlarut dalam 100 ml akuades
Stok vitamin primer Vitamin B1
100 mg Vitamin B2
5 mg Stok Trace Metal
ZnCl
2
2.1 gr CoCl
2
2 gr NH
4
6Mo
7
O
2
.4H
2
O 0.9 gr
CuSO
4
.5H
2
O 2 gr
Larutan media NaNO
3
10.0 g Na
2
EDTA 4.5 g
H
3
BO
3
3.36 g NaH
2
PO
4
.H
2
O 2.0 g
FeCl
3
.6H
2
O 0.13 g
MnCl
2
.4H
2
O 0.036 g
Stok Vitamin Primer 10 ml
Stok Trace Metal 0.1 ml
Media Walne dibuat dengan mencampurkan komposisi larutan media kecuali stok vitamin primer dan stok trace metal dalam akuades. Setelah terlihat
jernih, tambahkan 10 ml stok vitamin primer sampai terlarut dengan baik. Kemudian tambahkan 0.1 ml trace metal dan akuades hingga volume larutan
mencapai 100 ml. Setelah itu, media Walne ditempatkan di dalam botol gelap dan disimpan di lemari pendingin. Kultur mikroalga secara normal menggunakan
media Walne dengan penambahan EDTA Etilen Diamin Tetra Asetat, tetapi pada uji toksisitas media kulturnya menggunakan media Walne tanpa penambahan
EDTA.
Kultur untuk mengamati pertumbuhan C. gracillis dimulai dengan menambahkan 1 ml media Walne + EDTA pada satu liter air laut steril.
Kemudian ambil 100 ml air laut yang telah ditambahkan Walne ke dalam gelas Erlenmeyer 250 ml dan tambahkan C. gracillis sebanyak 1 ml. Sebelumnya
kepadatan awal C. gracilis dihitung dengan menggunakan haemocytometer di bawah mikroskop. Jumlah sel yang dihitung dengan menggunakan formula
sebagai berikut: Kepadatan =
0.00025 1000
400 x
x
................ 1 dimana x merupakan banyaknya jumlah sel yang terhitung Lampiran 1.
Satuan yang digunakan adalah sel per mililiter selml. Erlenmeyer tersebut kemudian ditutup dengan kapas yang bertujuan untuk menghindari masuknya
benda asing ke dalam wadah, setelah itu diaerasi dan diberi label yang mencantumkan spesies yang dikultur dan tanggal dimulainya kultur. Kepadatan
C. gracilis diharapkan dapat mencapai 1x10
6
selml dalam 4-7 hari. Mikroalga yang tidak dapat tumbuh secepat ini tidak dapat digunakan untuk uji pertumbuhan
96 jam. Pemeliharaan C. gracilis dilakukan dengan ulangan sebanyak 3 kali dalam minggu yang berbeda. Hasil kepadatan sel yang diperoleh kemudian diplotkan
dalam bentuk grafik dengan y adalah kepadatan sel dan x adalah hari pemeliharan.
3.3.3 Pembuatan larutan CdCl
