13
spermatogenik tidak rusak dan menghentikan proses disosiasi. Setelah itu, cairan diambil kembali menggunakan mikropipet sebanyak 1 μ L, diteteskan ke dalam
gelas objek cekung dan dilakukan penghitungan jumlah sel. Sel dihitung menggunakan haemositometer untuk penentuan dosis transplantasi.
3.4.1 Pewarnaan Sel Testikular Ikan Donor
Metode pewarnaan sel pada penelitian ini menggunakan PKH-26 SIGMA. PKH-26 adalah penanda yang mewarnai membran sel sehingga sel
tersebut akan berpendar warna merah ketika diamati di bawah mikroskop fluoresens filter merah Gambar 8b. Setelah sel testikular didisosiasi, sel
dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Diluent dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel sebanyak 3 kali volume sel 1 sel : 3 diluent. Pewarna
PKH-26 dimasukkan sebanyak 3 μ L. Setelah pencampuran tersebut, sel di dalam tabung mikro didiamkan selama kurang lebih 10 menit. Kemudian sel
disentrifugasi sebanyak dua kali dan supernatannya dibuang. Sel di dalam tabung mikro tersebut diisi kembali dengan larutan PBS sebanyak volume awal.
Gambar 8. Sel testikular ikan nila setelah pewarnaan dengan PKH-26; a Tanpa fluoresensi; b Dengan fluoresensi.
3.5 Teknik Transplantasi, dan Perlakuan Penelitian
Transplantasi sel dilakukan dengan menggunakan alat mikroinjektor mikroskop Stemi DV4, Zeiss Gambar 9a. Ikan resipien ditransplantasi dengan
dosis 5000 sel donor0,5µL PBSekor ikan Lacerda et al., 2008. Sel diinjeksikan pada rongga peritoneal larva menggunakan jarum mikroinjeksi yang digerakkan
secara manual dengan mikromanipulator. Transplantasi dilakukan pada larva berumur 3 hari setelah menetas Gambar 9b.
a a
b
14
Gambar 9. Satu set alat mikroinjeksi a, dan penyuntikan larva ikan nila di rongga peritoneal b.
3.6 Deteksi Kolonisasi Sel Donor
Deteksi kolonisasi sel donor dilakukan pada umur 30, 60, 90, dan 120 hari pascatransplantasi. Pada umur 30 hari sel donor dideteksi dengan menggunakan
mikroskop fluoresens untuk melihat pendaran dari PKH-26. Selanjutnya deteksi sel donor dilakukan dengan menggunakan marka molekuler hasil penelitian
sebelumnya. Gonad ikan transplan dibedah, dan DNA diekstraksi menggunakan kit seperti dijelaskan sebelumnya. DNA hasil ekstraksi diamplifikasi PCR dengan
menggunakan primer spesifik ikan nila putih. Hasil PCR dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 1,5.
3.7 Analisis Proliferasi Sel Donor
Proliferasi sel donor dianalisis dengan menggunakan PCR,
dan penghitungan GSI gonadosomatic index. Bobot tubuh dan gonad ikan hasil
transplantasi triploid, dan diploid, ikan triploid, dan diploid tanpa transplantasi diukur pada umur 60, 90, dan 120 hari. Selanjutnya DNA gonad diekstraksi, dan
digunakan dalam amplifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik ikan nila putih. Hasil amplifikasi PCR dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa
1,5.
3.8 Analisis Data
Keberhasilan transplantasi ditentukan dari persentase kolonisasi sel ikan donor di dalam gonad resipien, sedangkan proliferasi sel dilihat dari peningkatan
nilai GSI, dan hasil PCR setiap bulannya. Semua data disajikan dalam bentuk gambar, dan dianalisis secara deskriptif.
15
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil 4.1.1 Marka Molekuler Ikan Nila Putih
Kandidat marka molekuler untuk ikan nila putih didesain dari sekuen mtDNA ikan nila putih, dan ikan nila hitam. mtDNA dari ikan nila putih, dan
ikan nila hitam diamplifikasi dengan PCR Gambar 10, dan selanjutnya disekuensing untuk mendapatkan sekuen mtDNA Lampiran 1;2;3;4.
Gambar 10. Elektroforegram mtDNA ikan nila hitam H1-H5, dan ikan nila putih P1-P5 produk PCR menggunakan primer universal ikan nila. M=
marka DNA. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan
produk PCR target.
Gambar 11. Posisi primer forward, dan reverse ditunjukkan dengan tanda panah dari hasil penyejajaran mtDNA ikan nila hitam dan ikan nila putih.
