12
Inkubasi telur dilakukan pada saringan bulat yang diletakkan pada akuarium berisi air yang mengandung MB biru metilena dengan suhu berkisar
28-30
o
C. Akuarium diberi aerasi kuat agar telur tetap teraduk, dan pasokan oksigen tetap tersedia. Inkubasi embrio dilakukan selama 3-4 hari hingga menetas,
dan siap untuk ditransplantasi dengan sel donor dari ikan nila putih Gambar 7b.
Gambar 7. Heatshock telur di dalam waterbath a, dan inkubasi untuk penetasan telur dalam akuarium b.
3.4 Persiapan Sel Testikular Ikan Donor
Ikan donor yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan nila putih yang berumur sekitar 4 bulan. Prosedur persiapan sel testikular ikan donor
meliputi disosiasi testis, dan pewarnaan sel testikular.
3.4.1 Disosiasi Sel Testikular Ikan Donor
Ikan donor ditimbang, dan dibedah untuk diambil testisnya. Bobot testis diukur untuk digunakan dalam penghitungan jumlah sel testikular yang
terkandung. Sebelum dilakukan proses disosiasi, bagian permukaan luar testis dibersihkan menggunakan larutan bufer fosfat salin PBS. Tahap pertama yang
dilakukan adalah testis dipotong kecil – kecil dengan panjang sekitar 0,5 cm di cawan petri. Kemudian potongan testis dicacah sampai sedemikian kecil selama 3
– 5 menit. Setelah itu, 2 mL larutan tripsin 0,5 dalam PBS dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi potongan testis. Testis tersebut dicacah kembali
sambil disedot-sedot menggunakan pipet untuk pengadukan. Selanjutnya, larutan hasil cacahan testis diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung
mikro microtube. Larutan cacahan testis yang terdapat dalam tabung mikro disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Supernatan yang
terbentuk dibuang dan diganti dengan 1 μ L PBS. Hal ini dilakukan agar sel – sel
13
spermatogenik tidak rusak dan menghentikan proses disosiasi. Setelah itu, cairan diambil kembali menggunakan mikropipet sebanyak 1 μ L, diteteskan ke dalam
gelas objek cekung dan dilakukan penghitungan jumlah sel. Sel dihitung menggunakan haemositometer untuk penentuan dosis transplantasi.
3.4.1 Pewarnaan Sel Testikular Ikan Donor
Metode pewarnaan sel pada penelitian ini menggunakan PKH-26 SIGMA. PKH-26 adalah penanda yang mewarnai membran sel sehingga sel
tersebut akan berpendar warna merah ketika diamati di bawah mikroskop fluoresens filter merah Gambar 8b. Setelah sel testikular didisosiasi, sel
dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Diluent dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel sebanyak 3 kali volume sel 1 sel : 3 diluent. Pewarna
PKH-26 dimasukkan sebanyak 3 μ L. Setelah pencampuran tersebut, sel di dalam tabung mikro didiamkan selama kurang lebih 10 menit. Kemudian sel
disentrifugasi sebanyak dua kali dan supernatannya dibuang. Sel di dalam tabung mikro tersebut diisi kembali dengan larutan PBS sebanyak volume awal.
Gambar 8. Sel testikular ikan nila setelah pewarnaan dengan PKH-26; a Tanpa fluoresensi; b Dengan fluoresensi.
3.5 Teknik Transplantasi, dan Perlakuan Penelitian
