Spektrofotometer UV – VIS Metode Deoksiribosa
17
3.5.
Cara Kerja Penelitian
3.5.1.
Penyiapan Sampel
Biji kopi robusta yang didapatkan di pasar dan sudah dideterminasi untuk selanjutnya disiapkan untuk diekstraksi.
3.5.2.
Pembuatan ekstrak biji kopi
Pembuatan ekstrak biji kopi dilakukan oleh peneliti di laboratorium biologi. Biji kopi pertama digiling lalu disimpan dalam lemari pendingin sampai
dilakukannya analisis. Sampel kopi selanjutnya diekstrak dengan menggunakan pelarut etanol dan juga air, rasio perbadingan antara etanol dan air adalah 600 ml
: 400 ml. Kopi sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1 liter L etanol dan air, dengan perbandingan yang telah disebutkan diatas, setelah itu larutan
dihomogenkan menggunakan hot plate with magnetic stirer selama 3 jam dengan suhu 60° C setelahnya lakukan penyaringan dengan kertas saring. Setelah disaring
lakukan evaporasi menggunakan evaporator.
20
3.5.3.
Pembuatan Larutan
a Pembuatan Larutan DPPH Timbang 0,0007 gram DPPH
Larutkan dalam metanol sebanyak 14 ml Kocok larutan hingga homogen lalu masukan ke dalam botol gelap
Ukur absorbansi dengan menggunakan spektrofomotometer agar
mendapatkan panjang gelombang maksimum.
20
b Pembuatan Larutan kontrol negatif 2500 μl metanol dicampur dengan 500 μl larutan DPPH
Kocok larutan hingga homogen.
18
c Pembuatan Larutan uji 1. Larutan Induk 1000 ppm
10 g ekstrak biji kopi dilarutkan kedalam 10 ml etanol = 1000 ppm
2. Larutan Seri
Tabel 3.1 Pembuatan larutan seri ekstrak biji kopi
Konsentrasi ppm
Larutan Induk Biji Kopi
μl Etanol
μl DPPH
μl 50 ppm
600 μl
1900 μl
500 μl
100 ppm 450
μl 2050
μl 500
μl 150 ppm
300 μl
2200 μl
500 μl
200 ppm 150
μl 2350
μl 500
μl
a. Pembuatan Larutan Kontrol Positif
Vitamin C Nabavi sf 2011 1.
Larutan Induk 100 ppm 1
mg Vitamin C murni dilarutkan dalam 10 ml etanol 2
Larutan seri 2,4,6,8 ppm
3.6.
Pengukuran Absorbansi
Seluruh larutan kontrol, larutan ekstrak biji kopi dan larutan standar positif vitamin C dikocok menggunakan shaker waterbath dan diinkubasi pada suhu
37
o
C selama 30 menit dalam keadaan gelap ditutup alumunium foil. Hal ini dilakukan karena radikal DPPH mudah didegradasi oleh cahaya.
2
Ketika DPPH bereaksi dengan komponen, terjadi perubahan warna dan akan terbaca pada
spektrofotometer dengan panjang gelombang 516 nm. Selanjutnya ketika hasilnya sudah didapat dicari persen hambat masing masing larutan dengan menggunakan
rumus
16
:
Konsentrasi ppm
Larutan Induk Biji Kopi
μl Etanol
μl DPPH
μl 2 ppm
60 μl
2440 μl
500 μl
4 ppm 120
μl 2380
μl 500
μl 6 ppm
180 μl
2320 μl
500 μl
8 ppm 240
μl 2260
μl 500
μl
Tabel 3.2 Pembuatan larutan seri vitamin C