Alat – Alat Bahan – Bahan Larutan Blanko Kesimpulan

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Alat – Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : - Rotary Vacum Evaporator Buchi Rotavapor - Penangas uap Memmert - Autoklaf Yamato SN 20 - Inkubator FiberScientific - Cawan Petri - Pipet mikro Eppendorf - Kertas cakram Oxoid - Spektrofotometri UV-Visible Spectronic 3000 - Lemari pendingin Toshiba - Oven - Hot Plate PMC - Pinset - Jarum Ose - Jarum suntik - Jangka sorong - Corong pisah pyrex - Pipet volume pyrex - Buret pyrex

3.2 Bahan – Bahan

Bahan yang digunakan dalam penenlitian ini meliputi : - Daun Keji Beling - Ikan Nila - Etanol 96 Brataco - Etanol p.a p.a Merck - Nutrien Agar NA p.a Oxoid - NaCl p.a Merck - Muller Hinton Agar MHA p.a Oxoid - Potato dextrose Agar PDA p.a Oxoid - 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazil DPPH p.a Aldrich - Dimetilsulfoksida DMSO - Bacillus cereus - Shigella dysenteriae - Candida albicans - Microsporum gypseum - Isopropanol - N-heksan - Na 2 SO 4 anhidrous p.a Merck - Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O p.a Merck - Asam Asetat Glasial p.a Merck - Kloroform p.a Merck - KI - Indikator Amilum - Pereaksi Wagner - Pereaksi Mayer - Pereaksi Dragendorf - Pereaksi Bouchardat - CeSO4 1 - H 2 SO 4 10 - FeCl 3 1

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pembuatan Serbuk Daun Keji Beling

Daun Keji Beling Strobilanthes crispus BIsegar yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air hingga bersih dari kotoran yang melekat dan ditiriskan. Daun dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Kemudian dihaluskan dengan blender hingga menjadi serbuk dan disimpan dalam wadah yang tertutup.

3.3.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Pembuatan ekstrak etanol daun Keji Beling dilakukan dengan metode maserasi. Sebanyak 230 g serbuk daun Keji Beling dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer, ditambahkan pelrut etanol 96 hingga serbuk daun terendam. Didiamkan selama ± 48 jam dan ditutup dengan rapat. Selanjutnya filtrat yang dioeroleh dipekatkan dengan Rotary vacum Evaporator untuk memisahkan pelarutbnya hingga diperoleh ekstrak etanol dari daun Keji Beling, kemudian dipanaskan diatas penangas uap untuk menguapkan pelarut yang masih tersisa.

3.3.3 Skrining Fitokimia Senyawa Metabolit Sekunder

3.3.3.1 Uji Saponin

Filtrat etanol dari daun keji beling dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan akuades, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik.Jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 10 menit menunjukan adanya senyawa saponin.

3.3.3.2 Uji Terpenoid

Filtrat etanol dari daun keji beling diteteskanpada palt tipis, kemudian ditambah dengan CeSO 4 1 dalam H 2 SO 4 10 . Jika terbentuk warna merah kecoklatan menunjukkan adanya senyawa terpenoida.

3.3.3.3 Uji Fenolik

Filtrat etanol dari daun keji beling dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan pereaksi FeCl 3 1 .Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya senyawa fenolik.

3.3.3.4 Uji Alkaloida

Filtrat etanol dari daun keji beling dimasukkan kedalam 4 tabung reaksi dan selanjutnya ditambahkan dengan pereaksi alkaloida diantaranya : 1. Tabung I ditambahkan larutan pereaksi Wagner. Jika terbentuk endapan menggumpal berwarna coklat, menunjukkan adanya senyawa alkaloida. 2. Tabung II ditambahkan larutan pereaksi Mayer. Jika terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau putih kekuningan, menunjukkan adanya senyawa alkaloida. 3. Tabung III ditambahkan larutan pereaksi Bouchardat. Jika terbentuk endapan berwarna coklat kemerahan, menunjukkan adanya senyawa alkaloida. 4. Tabung IV ditambahkan larutan pereaksi Dragendorff. Jika terbentuk endapan warna merah atau jingga, menunjukkan adanya senyawa alkaloida.

3.3.4 Pengujian Aktivitas Antimikroba

3.3.4.1 Pembuatan Media MHA Muller Hinton Agar

Ditimbang sebanyak 9,5 gram serbuk MHA, kemudian dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer dan dilarutkan dengan 250 ml aquadest, diaduk dan dipanaskan hingga larut dan mendidih, lalu disterilkan dalam autoklaf pada 121 C selama 15 menit.

3.3.4.2 Pembuatan Media PDA Potato Dextrose Agar Miring dan Stok

Kultur Jamur Ditimbang sebanyak 9,75 gram media PDA, kemudian dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer dan dilarutkan dengan 250 ml aquadest, diaduk dan dipanaskan hingga larut dan mendidih, lalu disterilkan dalam autoklaf pada 121 C selama 15 menit.Kemudian dituangkan kedalam tabung reaksi sebnyak 3 ml dan dibiarkan memadat pada posisi miring membentuk sudut 30 -45 . Diambil jamur Candida albicansdan Microsporum gypseum dari strain utama dengan jarum ose lalu digoreskan pada media PDA miring yang telah memadat. Diinkubasi pada suhu 22 C selama 48 jam.

3.3.4.3 Pembuatan Media NA Nutrien Agar Miring dan Stok Kultur

Bakteri Ditimbang sebanyak 7 gram media NA, kemudian dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer dan dilarutkan dengan 250 ml aquadest, diaduk dan dipanaskan hingga larut dan mendidih, lalu disterilkan dalam autoklaf pada 121 C selama 15 menit. Kemudian dituangkan kedalam tabung reaksi sebnyak 3 ml dan dibiarkan memadat pada posisi miring membentuk sudut 30 -45 . Diambil bakteri Bacillus cereus danShigella dysentriaedari strain utama dengan jarum ose lalu digoreskan pada media NA miring yang telah memadat. Diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam.

3.3.4.4 Pembuatan Media NaCl 0,9

Ditimbang sebanyak 2,25 gram NaCl, kemudian dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer dan dilarutkan dengan 250 ml aquadest, diaduk dan dipanaskan hingga larut dan mendidih, lalu disterilkan dalam autoklaf pada 121 C selama 15 menit.

3.3.4.5 Pembuatan Inokulum Bakteri

Dimasukkan 5 ml media NaCl 0,9 steril kedalam tabung reaksi. Diambil koloni bakteri Bacillus cereus dari stok kultur bakteri dengan jarum ose, lalu disuspensikan kedalam media NaCl. Diinkubasi selama 1-2 jam pada suhu 35 C. Diukur kekruhan larutan pada panjang gelombang 560-600 nm hingga diperoleh transmitan 25-28. Dilakukan cara yang sama terhadap bakteri Shigella dysentriae.

3.3.4.6 Pembuatan Inokulum Jamur

Dimasukkan 5 ml media NaCl 0,9 steril kedalam tabung reaksi. Diambil koloni jamur Candida albicans dari stok kultur jamur dengan jarum ose, lalu disuspensikan kedalam media NaCl. Diinkubasi selama 1-2 jam pada suhu 22 C. Diukur kekruhan larutan pada panjang gelombang 580-600 nm hingga diperoleh transmitan 25-28. Dilakukan cara yang sama terhadap jamur Microsporum gypseum.

3.3.4.7 Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Keji Belling

Ekstrak daun keji beling diencerkan dengan pelarut DMSO. Dengan masing- masing konsentrasi 100, 200, 300, 400, dan 500 mgml.

3.3.4.8 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Dimasukkan 0,1 ml inokulum bakteri Bacillus cereus kedalam cawan petri. Ditambahkan 15 ml media MHA dengan suhu 45 -50 C. Dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur merata. Dibiarkan sampai media memadat. Diletakkan kertas cakram yang telah direndam dengan berbagai variasi konsentrasi ekstrak daun keji beling kedalam cawan petri. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C. Diukur diameter zona bening yang ada disekitar kertas cakram dengan jangka sorong. Dilakukan perlakuan yang sama untuk bakteri Shigella dysentriae.

3.3.4.9 Uji Aktivitas Antijamur Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Dimasukkan 0,1 ml inokulum jamur Candida albicans kedalam cawan petri. Ditambahkan 15 ml media PDA dengan suhu 45 -50 C. Dihomogenkan sampai media dan jamur tercampur merata. Dibiarkan sampai media memadat. Diletakkan kertas cakram yang telah direndam dengan berbagai variasi konsentrasi ekstrak daun keji beling kedalam cawan petri. Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 22 C. Diukur diameter zona bening yang ada disekitar kertas cakram dengan jangka sorong. Dilakukan perlakuan yang sama untuk jamur Microsporum gypseum.

3.3.5 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Keji Beling dengan

Metode DPPH 2,2 Diphenyl-1-picrylhidrazyl

3.3.5.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mM

Ditimbang serbuk DPPH sebanyak 11,85 mg. kemudian dilarutkan dalam etanol p.a pada labu takar 100 ml, dan dihomogenkan.

3.3.5.2 Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Ekstrak etanol daun keji beling ditimbang sebanyak 0,025 g dan dilarutkan dengan etanol p.a kedalam labu takar 25 ml sehingga diperoleh larutan induk 1000 ppm. Kemudian dari larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm, dan dari larutan 100 ppm dibuat variasi konsentrasi larutan 20. 40, 60, dan 80 ppm.

3.3.5.3 Uji Aktivitas Antioksidan

a. Larutan Blanko

Sebanyak 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dimasukkan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan 2,5 ml etanol p.a, dihomogenkan dan dibiarkan pada ruang gelap selama 30 menit. Diukur absorbansi dengan panjang gelombang 517 nm.

b. Larutan Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Sebanyak 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dimasukkan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan 2,5 ml ekstrak daun keji belling 20 ppm, dihomogenkan dan dibiarkan pada ruang gelap selama 30 menit. Diukur absorbansi dengan panjang gelombang 517 nm. Dilakukan cara yang sama untuk ekstrak daun keji beling 40, 60 dan 80 ppm.

3.3.8 Aplikasi Antioksidan Pada Daging Ikan Nila

3.3.8.1 Preparasi Daging Ikan Nila

Sebanyak 1 kg ikan nila segar dibersihkan dan dipisahkan dagingnya dari kulit dan duri. Selanjutnya daging ikan nila yang telah terpisah dari duri dan kulitnya di haluskan dengan menggunakan blender dan dibagi menjadi 5 bagian kedalam aluminium foil. Masing – masing sebanyak 100 g disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 o C dengan penambahan ekstrak etanol daun keji beling dengan variasi konsentrasi 20, 40, 60, dan 80 ppm, dan daging ikan nila tanpa tambahan ekstrak etanol daun keji beling.

3.3.8.2 Ekstraksi Minyak Daging Ikan Nila

Daging ikan nila yang telah disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 o C, ditambahkan dengan 400 ml heksana : isopropanol 3:2. Campuran diblender selama 2 menit.Kemudian suspensi disaring hingga residu menjadi kering. Residu ditambahkan dengan 180 ml heksana : isopropanol 3:2 dan diblender kembali, disaring dan residu yang diperoleh ditambahkan lagi dengan 150 ml heksana : isopropanol 3:2, kemudian diblender dan disaring. Filtrat hasil ekstraksi dikumpulkan dan dimasukkan kedalam corong pisah. Kemudian ditambahkan dengan 80 ml larutan Na 2 SO 4 6,67 dan dihomogenkan selama 1 menit, didiamkan hingga membentuk lapisan. Lapisan atas ditambahkan dengan 5 gramNa 2 SO 4 anhidrous, disaringdan filtrat dipekatkan dengan rotari vacum evaporator.

3.3.8.3 Penentuan Bilangan Peroksida

Sebanyak 0,5 g minyak ikan yang diperoleh dari ekstraksi daging ikan nila dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 250 ml. Kemudian ditambahkan 30 ml campuran larutan asam asetat glasial : kloroform dengan perbandingan 3:2. Selanjutnya, ditambahkan 0,5 ml larutan KI, ditutup dan dikocok selama ± 2 menit. Kemudian ditambahkan 30 ml akuades dan dititrasi dengan larutan Na 2 S 2 O 3 0,0036 N hingga larutan berwarna kuning pucat, kemudian ditambahkan 1 ml indikator amilum 1 yang kemudian dititrasi kembali dengan Na 2 S 2 O 3 0,0036 N sampai warna yang terbentuk hilang, dihitung dan dicatat volume Na 2 S 2 O 3 0,0036 N yang terpakai.

3.4 Bagan Penelitian

Daun Keji Beling Serbuk Daun Keji Beling Ekstrak Etanol Keji Beling Filtrat Etanol dari Daun Keji Beling Golongan Alkaloid Golongan Terpen Golongan Fenolik Golongan Saponin Hasil Hasil Hasil Hasil

3.4.1 Ekstraksi Daun Keji Beling Strobilanthes crispus BI

Dicuci Dikering anginkan Dihaluskan Dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer Direndam dengan etanol 96 selama 48 jam ± 2 hari Dipekatkan dengan Rotary Vacum Evaporator Dipanaskan dengan penangas uap

3.4.2 Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi secukupnya

3.4.2 Uji Aktivitas Antimikroba

Ditambah- kan dengan akuades Dikocok Ditambah- kan dengan pereaksi FeCl 3 1 Ditambah- kan dengan pereaksi CeSO 4 1 dalam H 2 SO 4 10 Ditambahkan pereaksi wagner Ditambahkan pereaksi meyer Ditambahkan pereaksi dragendorff Ditambahakan pereaksi bouchardat

3.4.2.1 Pembuatan Media Muller Hinton Agar MHA

Dilarutkan dengan 250 ml aquades kedalam LabuErlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit

3.4.2.2 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar PDA dan Stok Kultur

Jamur Dilarutkan dengan 250 ml aquades kedalam Labu Erlenmeyer Dipanaskan sambal diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml Dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring Diambil jamur Candida albicans dari strain utama dengan jarum ose lalu digoreskan ke dalam media PDA yang telah memadat Diinkubasi pada suhu 22 C selama 48 jam Dilakukan perlakuan yang sama untuk jamur Microsporum gypseum

3.4.2.3 Pembuatan Media Nutrien Agar NA dan Stok Kultur Bakteri

9,5gram media MHA Muller HintonAgar Media MHA Muller Hinton Agar steril 9,75gram media PDA Potato Dextrose Agar Media PDA Potato Dextrose Agar steril Stok Kultur Jamur Candida albicans Dilarutkan dengan 250 ml aquades kedalam Labu Erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Dituangkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml Dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring Diambil bakteri Bacillus cereus dari strain utama dan digoreskan secara aseptik dengan jarum ose ke dalam media NA yang telah memadat Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C Dilakukan perlakuan yang sama untuk bakteri Shigella dysentriae

3.4.2.4 Pembuatan Inokulum Bakteri

7gram media NA Nutrien Agar Media NA Nutrien Agar steril Stok Kultur BakteriBacillus cereus Dilarutkan dengan 100 ml aquades kedalam labu Erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 5 ml Diambil koloni bakteri Bacillus cereus dari stok kultur bakteri dengan jarum ose Disuspensikan kedalam media NaCl Diinkubasi selama 1-2 jam pada suhu 35 C Diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 560- 600 nm sampai diperoleh transmitan 25-28 Dilakukan perlakuan yang sama untuk bakteri Shigella dysentriae

3.4.2.5 Pembuatan Inokulum Jamur

2,25 gram NaCl Media NaCl 0,9 steril Inokulum bakteri Bacillus cereus Dilarutkan dengan 100 ml aquades kedalam labu Erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 5 ml Diambil koloni jamur Candida albicans dari stok kultur jamur dengan jarum ose Disuspensikan kedalam media NaCl Diinkubasi selama 1-2 jam pada suhu 22 C Diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580- 600 nm sampai diperoleh transmitan 25-28 Dilakukan perlakuan yang sama untuk jamur Microsporum gypseum

3.4.2.6 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

2,25 gram NaCl Media NaCl 0,9 steril Inokulum jamur Candida albicans Hasil Hasil Dimasukkan kedalam cawan petri Ditambahkan 15 ml media MHA dengan suhu 45 -50 C Dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata Dibiarkan sampai media memadat Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak etanol daun Keji Beling dengan berbagai konsentrasi kedalam cawan petri Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C Diukur diameter zona bening disekitar cakram dengan jangka sorong Dilakukan perlakuan yang sama untuk bakteri Shigella dysentriae

3.4.2.7 Uji Aktivitas Antijamur Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Dimasukkan kedalam cawan petri Ditambahkan 15 ml media PDA dengan suhu 45 -50 C Dihomogenkan sampai media dan jamur tercampur rata Dibiarkan sampai media memadat Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak etanol daun Keji Beling dengan berbagai konsentrasi kedalam cawan petri Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 22 C Diukur diameter zona bening disekitar cakram dengan jangka sorong Dilakukan perlakuan yang sama untuk jamur Microsporum gypseum 0,1 ml inokulum bakteri Bacillus cereus 0,1 ml inokulum jamur Candida albicans 0,025 g Estrak Etanol Daun Keji Beling 20 ppm 25 ml Larutan Induk 1000 ppm 25 ml Larutan Induk 100 ppm 40 ppm 60 ppm 80 ppm

3.4.3 Uji Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Keji Beling dengan Metode

DPPH Dimasukkan dalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas Dihomogenkan Dipipet 2,5 ml Larutan Induk 1000 ppm Dimasukkan dalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas Dihomogenkan Dibuat variasi 20, 40, 60 dan 80 ppm Dimasukkan 2,5 ml masing – masing variasi ekstrak kedalam tabung reaksi yang berisi 1 mllarutan DPPH 0,3 mM Dihomogenkan Dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan gelap Diukur absorbansi pada panjang gelombang 517 nm Hasil Dipipet 5 ml dengan pipet volume Dimasukkan kedalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas Dihomogenkan Dipipet 10 ml dengan pipet volume Dimasukkan kedalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas Dihomogenkan Dipipet 15 ml dengan pipet volume Dimasukkan kedalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas Dihomogenkan Dipipet 20 ml dengan pipet volume Dimasukkan kedalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas Dihomogenkan 1 kg Daging ikan nila

3.4.4 Aplikasi Antioksidan Terhadap Daging Ikan Nila

3.4.4.1 Preparasi Daging Ikan Nila

Dibersihkan Dipotong kecil-kecil Diblender Dibagi menjadi 5 bagian Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 Sampel 5 Disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 o C Ditambah- kan 1 ml ekstrak etanol daun keji beling 20 ppm Disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 o C Ditambah- kan 1 ml ekstrak etanol daun keji beling 40 ppm Disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 o C Ditambah- kan 1 ml ekstrak etanol daun keji beling 60 ppm Disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 o C Ditambah- kan 1 ml ekstrak etanol daun keji beling 80 ppm Disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 o C 100 g daging ikan nila 100 g daging ikan nila 100 g daging ikan nila 100 g daging ikan nila 100 g daging ikan nila

3.4.4.2 Ekstraksi Minyak Daging Ikan Nila

Ditambah 400ml n-heksan : isopropanol 3:2 dan diblender selama 2 menit Disaring dengan corong Buchner Ditambah 180ml n-heksan : isopropanol 3:2 dan diblender Disaring Ditambah 150ml n–heksan : isopropanol 3:2 dan diblender Disaring Dimasukkan ke dalam corong pisah Dimasukkan 80 ml larutan Na 2 SO 4 6,67 Dihomogen selama 1 menit Didiamkan Dipisahkan Dimasukkan ke labu Erlenmeyer Ditambahkan 5 g Na 2 SO 4 Anhidrous Disaring Dipekatkan dengan rotary vacum evaporator Dengan prosedur yang sama lakukan untuk sampel 2, 3, 4, dan 5 Sampel 1 Larutan Suspensi Residu I Filtrat I Residu II Filtrat II Filtrat III Residu III Filtrat bening kekuningan Lapisan bawah Lapisan tengah Lapisan atas Filtrat bening kekuningan Residu Minyak Ikan

3.4.4.3 Penentuan Bilangan Peroksida

Dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer Ditambahkan 30ml asam asetat glasial : kloform 3:2 Ditambahkan 0,5 ml KI jenuh Ditutup Dikocok selama 2 menit Ditambahkan 30ml akuades Dititrasi dengan larutan Na 2 S 2 O 3 0,0036 N Ditambahkan 1 ml indikator amilum 1 Dititrasi kembali dengan larutan Na 2 S 2 O 3 0,0036 N Dicatat volume larutan Na 2 S 2 O 3 0,0036 N yang terpakai Dihitung bilangan peroksidanya Dengan prosedur yang sama dilakukan untuk sampel 2, 3, 4, dan 5. 0,5 g Minyak Sampel 1 Larutan Kuning Pucat Larutan Bening Hasil BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Ekstrak etanol daun keji beling diperoleh dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96 , diskrining fitokimia untuk mengetahui senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid, fenolik, saponin dan terpen yang ditunjukkan pada tabel 4.1 sebagai berikut : Table 4.1 Hasil skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Keji Beling Golongan Pereaksi Hasil Skrining Fitokimia Saponin Akuades - Terpen CeSO 4 1 dalam H 2 SO 4 10 - Fenolik FeCl 3 1 + Alkaloid Bouchardat + Wagner + Meyer - Dragendorf + Keterangan : - : tidak terjadi perubahan warnaendapan + : terjadi perubahan warnaendapan Perubahan warnaendapan menunjukkan adanya kandungan senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid, fenolik, saponin, dan terpen.

4.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Aktivitas antimikroba ditentukan beradasarkan metode difusi agar.Kemampuan ekstrak etanol daun keji beling dalam menghambat pertumbuhan mikroba ditentukan berdasarkan diameter zona bening yang terbentuk disekitar kertas cakram dan ditentukan dengan menggunakan jangka sorong. Ekstrak etanol daun keji beling menunjukkan zona bening pada pertumbuhan jamur Candida albicans dan tidak menunjukkan zona bening yang efektif pada pertumbuhan jamur Microsporum gypseum, serta bakteri Shigella dysentriae dan Bacillus cereus seperti yang ditunjukkan pada gambar berikut ini : Gambar 4.1 Zona Hambat Jamur Candida albicans Gambar 4.2 Zona Hambat Jamur Microsporum gypseum Gambar 4.3 Zona Hambat Bakteri Bacillus cereus Gambar 4.4 Zona Hambat Bakteri Shigella dysentriae Adapun hasil pengukuran diameter zona bening dari mikroba tersebut yang ditunjukkan pada tabel 4.2 berikut ini : Tabel 4.2 Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat Mikroba Konsentrasi Ekstrak Diameter Zona Hambat mm Candida albicans Microsporum gypseum Bacillus cereus Shigella dysentriae 100 mgml 11,53 - - - 200 mgml 13,96 - - - 300 mgml 15,46 - - - 400 mgml 16,8 - - - 500 mgml 18,2 10,6 - - Keterangan : - : Tidak ada hambatan

4.1.3 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun keji beling dilakukan dengan metode radikal bebas DPPH menggunakan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 517 nm untuk memperoleh nilai IC 50 , dengan mengamati perubahan absorbansi pada larutan DPPH yang ditunjukkan pada tabel 4.3 sebagai berikut : Tabel 4.3 Hasil Pengukuran Absorbansi Ekstrak Etanol Daun Keji Beling Konsentrasi Sampel Absorbansi Peredaman Blanko 0,955 - 20 ppm 0,849 11,099 40 ppm 0,772 19,162 60 ppm 0,745 21,989 80 ppm 0,720 24,607 dari persamaan garis linier diperoleh IC 50 sebesar 155,2 ppm

4.1.4 Hasil Aplikasi Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Terhadap Daging Ikan Nila Ekstraksi minyak dari daging ikan nila dilakukan dengan menggunakan pelarut n- heksana : isopropanol. Dimana sebanyak 100 g daging ikan nila ditambahkan dengan 1 ml ekstrak etanol daun keji beling 20, 40, 60, dan 80 ppm dan disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 C. Minyak yang diperoleh dari hasil ekstraksi daging ikan nila yang telah ditambahkan ekstrak etanol daun keji beling dan tanpa penambahan ekstrak diuji bilangan peroksida dengan metode titrasi iodometri. Hasil bilangan peroksida dijtunjukkan pada tabel 4.4 sebagai berikut : Tabel 4.4 Hasil Penentuan Bilangan Peroksida dari Minyak Daging Ikan Nila Bilangan Peroksida meqkg Sampel Minyak daging ikan Nila S1 S2 S3 S4 S5 25,5 21,6 18,72 15,84 14,4 Keterangan : S1 = Daging ikan nila penyimpanan 5 hari S2 = Daging ikan nila + ekstrak 20 ppm penyimpanan 5 hari S3 = Daging ikan nila + ekstrak 40 ppm penyimpanan 5 hari S4 = Daging ikan nila + ekstrak 60 ppm penyimpanan 5 hari S5 = Daging ikan nila + ekstrak 80 ppm penyimpanan 5 hari

4.2 Pembahasan

4.2.1 Skrining Fitokimia Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak

Etanol Daun Keji Beling Berdasarkan hasil skrining fitokimia, diperoleh bahwa ekstrak etanol daun keji beling pada golongan saponin dengan penambahan akuades, tidak menunjukkan adanya pembentukan busa yang stabil saat dikocok.Pada golongan terpen dengan pereaksi CeSO 4 1 dalam H 2 SO 4 10 , tidak membentuk endapan berwarna coklat kemerahan.Pada golongan fenolik dengan pereaksi FeCl 3 1 terbentuk endapan kehitaman.Pada golongan alkaloid dengan pereaksi Wagner, Bouchardat, dan Dragendorf terjadi perubahan warna dan pembentukan endapan, sedangkan dengan pereaksi Meyer tidak terjadi pembentukan endapan putih kekuningan.Sehingga, ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun keji beling mengandung senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid dan fenolik.Isnawati, A dkk 2004 juga telah melakukan penelitian tentang karakterisasi simplisia dan ekstrak daun Strobilanthus crispus.Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun Strobilanthus crispus positif mengandung senyawa alkaloid dan fenolik.

4.2.2 Aktivitas Antimikroba Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Aktivitas antimikroba ekstrak etanol daun keji beling terhadap empat jenis mikroba yaitu Candida albicans, Microspoprum gypseum, Bacillus cereus dan Shigella dysentriae memberikan hasil zona hambat yang berbeda.Mikroba uji yang paling sensitif terhadap ekstrak etanol daun keji beling adalah candida albicans.Mikroba uji Microsporum gypseum, Bacillus cereus dan Shigella dysentriae tidak dapat dihambat dengan baik oleh ekstrak etanol daun keji beling. Davis dan Stout dalam Kesuma 2010 mengemukakan bahwa kekuatan daya antibakteri adalah daerah hambatan 20 mm atau lebih termasuk sangat kuat, daerah hambatan 10-20 mm kategori kuat, daerah hambatan 5-10 mm kategori sedang, dan daerah hambatan 5 mm atau kurang termasuk kategori lemah. Adanya perbedaan diameter zona hambat pada keempat mikroba menunjukkan bahwa terdapat perbedaan sensitivitas ekstrak pada mikroba uji tersebut. Senyawa yang bersifat sebagai antimikroba dapat menyebabkan kerusakan pada dinding sel serta kerusakan pada membran sel berupa denaturasi protein dan lemak yang menyusun membran sel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa zona hambat terjadi pada jamur Candida abicans dimulai pada konsentrasi 100 mgml dan terus meningkat hingga konsentrasi 500 mgml. Sedangkan pada jamur Microsporum gypseum, zona hambat terbentuk dimulai pada konsentrasi 500 mgml. Hal ini disebabkan karena jamur Microsporum gypseum merupakan jamur berfilamen yang multiseluler, sedangkan jamur Candida albicans merupakan jamur uniseluler. Namun, pada bakteri Bacillus cereus dan Shigella dysentriae tidak mampu dihambat pertumbuhannya oleh ekstrak etanol daun keji beling. Hal ini diperkirakan karena berdasarkan hasil skrining fitokimia ekstrak etanol daun keji beling mengandung senyawa alkaloid dan fenolik. Dimana dalam penelitian ini diduga alkaloid yang lebih berperan terhadap aktivitas antijamur pada jamur Candida albicans. Alkaloid merupakan suatu senyawa yang bersifat basa, yang mengandung atom nitrogen. Rahayu et al 2009, mengatakan bahwa alkaloid memiliki sifat basa pH7 dan pahit. Sifat basa ini kemungkinan akan menekan pertumbuhan jamur Candida albicans, karena jamur tersebut tumbuh pada pH 3,8-5,6. Pada penelitian ini juga dilakukan pembanding dengan menggunakan antibiotik Chloramphenicol terhadap bakteri Bacillus cereus dan Shigella dysentriae serta antibiotik Nystatin terhadap jamur Candida albicans dan Microsporum gypseum. Antibiotik Chloramphenicol 50 mgml menghasilkan zona hambat sebasar 36,15 mm pada bakteri Bacillus cereus dan 30,63 mm pada bakteri Shigella dysentriae. Dapat dilihat bahwa, ekstrak etanol daun keji beling tidak menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri jika dibandingkan dengan antibiotik tersebut. Berbeda halnya dengan antibiotik Nystatin. 10000 unit Nystatin menghasilakn zona hambat sebesar 16,37 mm pada jamur Candida albicans dan 12,56 mm pada jamur Microsporum gypseum. Bardasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun keji beling pada konsentrasi 400 mgml menunjukkan aktivitas yang sebanding dengan 10000 unit antibiotik Nystatin pada jamur Candida albicans. Sedangkan pada konsentrasi 500 mgml tidak menunjukkan aktivitas yang sebanding dengan 10000 unit Nystatin pada jamur Microsporum gypseum. Adapun zona hambat yang dibentuk oleh antibiotik terhadap pertumbuhan mikroba, ditunjukkan pada gambar berikut ini : a b c d Gambar 4.5 Antibiotik Pembanding Chloramphenicol terhadap bakteri a Bacillus cereus b Shigella dysentriae Antibiotik Pembanding Nystatin terhadap jamur c Candida albicans d Microsporum gypseum

4.2.3 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Keji Beling

Ekstrak etanol daun keji beling dilakukan uji aktivitas antioksidan demgan menggunakan DPPH sebagai radikal sintetik yang stabil dan diukur absorbansinya dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-Visble pada panjang gelombang 517 nm. Mekanisme umum peredaman radikal bebas DPPH oleh antioksidan dapat dilihat pada gambar 4.6 sebagai berikut : Gambar 4.6 Mekanisme Peredaman Radikal DPPH Yuhernita dan Juniarti. 2011 Prinsip dari metode DPPH ini adalah inetraksi antara senyawa yang bersifat sebagai antioksidan dengan DPPH, baik secara transfer elektron ataupun hidrogen pada DPPH maka akan menetralkan sifat radikal bebas dari DPPH. Setelah semua elektron pada radikal bebas DPPH berpasangan, maka larutan akan berubah warna dari ungu tua menjadi kuning terang dan diikuti dengan penurunan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm Green, R.J. 2004 Pada tabel 4.3 menunjukkan telah terjadi peredaman radikal bebas DPPH setelah penambahan ekstrak etanol daun keji beling.Dimana semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka peredaman semakin tinggi yang disertai dengan penurunan absorbansi dari larutan radikal bebas DPPH tersebut. Aktivitas antioksidan dapat dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50 atau IC 50 , yaitu konsentrasi sampel yang dapat meredam radikal bebas DPPH sebanyak 50 .Nilai IC 50 diperoleh dari persamaan garis regresi setelah mengganti y dengan 50 Bendra, A. 2012. Sehingga diperoleh nilai IC 50 untuk ekstrak etanol daun keji beling sebesar 155,2 ppm. Berdasarkan hasil skrining fitokimia, ekstrak etanol daun keji beling mengandung senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid dan fenolik. Senyawa fenolik mempunyai gugus –OH yang terikat pada karbon cincin aromatik. Aktivitas peredaman radikal bebas senyawa fenolik diyakini dipengaruhi oleh jumlah dan posisi hidrogen fenolik dalam molekulnya. Dengan demikian aktivitas antioksidan yang lebih tinggi akan dihasilkan pada senyawa fenolik yang mempunyai jumlah gugus hidroksil yang lebih banyak. Senyawa fenolik ini mempunyai kemampuan untuk menyumbangkan hidrogen. Produk radikal bebas yang terbentuk pada senyawa fenolik akan terstabilkan oleh resonansi, sehingga dapat berfungsi sebagai antioksidan yang efektif. Senyawa alkaloid, terutama indol, memiliki kemampuanuntuk menghentikan reaksi rantai radikal bebas secara efisien. Mekanisme alkaloid sebagai antioksidan adalah dengan cara mendonorkan atom hidrogen pada radikal bebas. Beberapa senyawa alkaloid lain yang bersifat antioksidan adalah quinolon, kafein yang dapat bertindak sebagai peredam radikal hidroksil dan melatonin yang berperan penting menjaga sel dari pengaruh radiasi dan toksisitas obat-obatan Yuhernita dan Juniarti. 2011. Mekanisme peredaman radikal bebas oleh senyawa fenolik dan alkaloid dapat dilihat pada gambar 4.7 sebagai berikut : O O O O OH + DPPH O + DPPH-H Gambar 4.7 Mekanisme peredaman radikal bebas oleh senyawa fenolik Fessenden dan Fessenden. 1994 Gambar 4.8 Mekanisme peredaman radikal bebas oleh senyawa alkaloid Yuhernita dan Juniarti. 2011 Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Yuhernita dan Juniarti 2011, IC 50 untuk vitamin C sebagai kontrol positif antioksidan adalah sebesar 9,23 mgL. Jika dibandingkan dengan IC 50 ekstrak etanol daun keji beling, maka aktivitas antioksidan nya masih kecil dibandingkan dengan aktivitas antioksidan dari vitamin C.

4.2.4 Aplikasi Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Keji beling Terhadap

Daging Ikan Nila Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun keji beling dengan metode DPPH menghasilkan nilai IC 50 sebesar 155,2 ppm. Sehingga untuk mengetahui pengaruh sifat antioksidannya, maka ekstrak etanol daun keji beling diaplikasikan terhadap daging ikan nila yang disimpan selama 5 hari pada suhu ± 5 C. Sifat antioksidan nya ditentukan dengan bilangan peroksida. Bilangan peroksida adalah bilangan yang menentukan derajat kerusakan suatu minyak. Asam lemak tak jenuh dalam minyak diketahui dapat mengikat oksigen pada ikatan rangkapnya sehingga membentuk peroksida Ketaren. 1986 Pada tabel 4.4 menunjukkan bahwa bilangan peroksida dari minyak dari daging ikan nila semakin menurun dengan bertambahnya konsentrasi ekstrak eatnol daun keji beling dan lebih rendah jika dibandingkan dengan kontrol yaitu minyak dari daging ikan nila tanpa penambahan ekstrak.Hal ini memperlihatkan bahwa adanya penambahan ekstrak etanol daun keji beling, memberikan pengaruh untuk menghambat oksidasi yang terjadi.Berdasarkan hasil skrining fitokimia, ekstrak etanol daun keji beling mengandung senyawa metabolit sekunder golongan fenolik dan alkaloid yang mampu bersifat sebagai antiokisidan. Antioksidan mampu menghambat terbentukanya radikal bebas dan menghambat kelanjutan reaksi autooksidasi.Hal ini desebabkan karena antioksidan memiliki energi aktivasi yang rendah untuk melepaskan satu atom hidrogen kepada radikal lemak, sehingga tahap oksidasi lebih lanjut dapat dicegah Khamidinal, dkk. 2007.Mekanisme antioksidan dalam menghambat oksidasi atau menghentikan reaksi berantai pada radikal bebas dari lemak yang teroksidasi, dapat disebabkan oleh bebrapa macam mekanisme reaksi yaitu, pelepasan hidrogen dari antioksidan, pelepasan elektron dari antioksidan. Ketaren.1986 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Ekstrak etanol daun keji beling mengandung senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid dan fenolik. 2. Ekstrak etanol daun keji beling Strobilanthes crispus BI memiliki aktivitas sebagai antimikroba yang efektif terhadap jamur Candida albicans dan tidak efektif pada jamur Microsporum gypseum, Bakteri Bacillus cereus dan Shigella dysentriae. 3. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun keji beling dengan metode DPPH memiliki nilai IC 50 sebesar 155,2ppm. Sifat antioksidan terhadap daging ikan nila menunjukkan bilangan peroksida yang semakin kecil seiring dengan penambahan konsentrasi ekstrak etanol daun keji beling yang semakin besar.

5.2 Saran