METODE PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner kesmavet Bambu Apus DKI Jakarta, dimulai sejak bulan September 2005
sampai dengan bulan Januari 2006.
3.2. Sampel Penelitian
Materi penelitian sebanyak 31 tiga puluh satu ekor ayam pedaging diperoleh dari 6 pasar tradisional di Wilayah Kabupaten Tangerang. Materi
tersebut diambil dari pasar tradisional selama 6 hari berturut-turut. Selanjutnya seluruh sampel yang diperoleh dilakukan pengujian terhadap residu antibiotika di
laboratorium Kesmavet Bambu Apus DKI Jakarta.
3.3. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah, erlenmeyer, pipet volumetrik, mixer, sentrifus, water bath, magnetik stirer, homogenizerstomacher, autoclave,
refrigerator, freezer, kertas cakram dan stomacher plastik bags. Bahan
yang digunakan
yaitu, bacto peptone, bacto agar, beef extract,
yeast extract, D+ glucose, tryptone, spora bakteri Bacillus calidolactis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Micrococcus luteus.
3.4. Cara Pengujian Residu Antibiotika
Pengujian antibiotika dilakukan dengan metode biologik yaitu, metode Bio-AssayScreening test menggunakan spora bakteri Bacillus calidolactis,
Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Micrococcus luteus. Laboratorium Kesmavet Bambu Apus DKI Jakarta menggunakan metode ini untuk pengujian residu
antibiotika pada produk ternak seperti, daging, susu dan telur. Metode ini diadopsi dari beberapa literatur dengan beberapa modifikasi.
27
3.4.1. Golongan Penisilin Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Bacillus calidolactis ditambahkan dalam agar miring dan
diinkubasi pada suhu 55 C selama 2 dua minggu. Kemudian bakteri yang
ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan aquabides steril 20 ml, sebanyak 4 tabung sentrifuge, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu
65 C selama 30 menit. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit
buang supernatan lapisan atasnya. Kedalam endapan tambahkan aquabides secukupnya, dikocok dan
dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 4 C selama 18-24 jam. Kemudian
larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 65 C selama 30 menit,
setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 5 gr tryptone, 12 gr yeast extract, 1 gr dextrose dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1
dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat Buffer
Sebanyak 13,3 gr KH
2
PO
4
dan 6,2 gr Na
2
HPO
4
dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
3.4.2. Golongan Tetrasiklin Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Bacillus cereus ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi
pada suhu 30 C selama 1 satu minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan
tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis steril 20 ml, sebanyak 4 tabung sentrifus, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 65
C
28 selama 18-24 jam. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit
buang supernatan lapisan atasnya. Kedalam endapan tambahkan NaCl fisiologis secukupnya, dikocok dan
dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 4 C selama 18-24 jam. Kemudian
larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 65 C selama 30 menit,
setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 6 gr peptone, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast extract, 1,35 gr KH
2
PO
4
, dan 15-16 bacto agar dalam 1000 ml aquadest, kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat Buffer
Sebanyak 3,5 gr KH
2
PO
4
dan 3 gr Na
2
HPO
4
dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
3.4.3. Golongan Makrolida Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Micrococcus luteus ditambahkan dalam agar miring dan
diinkubasi pada suhu 36 C selama 18-24 jam. Kemudian diambil 1 ose kuman
biakan Micrococcus luteus ke dalam 10 ml media Heart Infusion Broth HIB. Selanjutnya diinkubasikan selama 18-24 jam dalam inkubator suhu 36
C. Kuman
siap digunakan untuk pengujian. Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 6 gr peptone, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast extract, 1 gr D+glukosa dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades,
kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit.
29
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat Buffer
Sebanyak 7 gr KH
2
PO
4
dan 6 gr Na
2
HPO
4
dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit.
3.4.4. Golongan Aminoglikosida Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Bacillus subtilis ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 36
C selama 1 satu minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan aquabides 20ml, sebanyak 4 tabung
sentrifuge, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 65 C selama 30 menit.
Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit dibuang supernatan lapisan atasnya.
Kedalam endapan tambahkan aquabides secukupnya, dikocok dan dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 4
C selama 18-24 jam. Kemudian larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 65
C selama 30 menit, setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil
lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 5 gr peptone, 3 gr beef extract, 3 gr yeast extract, dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1
dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15
menit.
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat Buffer
Sebanyak 6,4 gr KH
2
PO
4
dan 18,9 gr Na
2
HPO
4
dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit.
30
3.4.5. Kalibrasi SporaKuman
Media di panaskan dan simpan di dalam waterbath pada suhu 55 C.
Kemudian di ambil sebanyak 100 ml, tambahkan spora yang akan diuji dan di kocok hingga larutan media dan kuman tercampur rata. Di pipet kultur media
masing-masing sebanyak 8 ml dilakukan 3 kali pengulangan dan dibiarkan memadat. Kertas cakram paper disk diletakkan diatas permukaan kultur media
dan ditetesi dengan larutan baku standar antibiotika. Sebelum diinkubasikan spora dibiarkan pada suhu kamar selama 1 jam. Inkubasikan di dalam inkubator dengan
suhu sesuai dengan spora yang diuji, selama 18-24 jam. Hasil ditentukan dengan mengukur diameter daerah hambatan dengan menggunakan jangka sorongkaliper
3.4.6. Penghitungan Spora Bakteri
Dari contoh suspensi diatas dibuat pengenceran berseri sampai dengan 10
-8
, setiap konsentrasi pengenceran ditu ang ke dalam cawan petri masing-masing 1
ml dilakukan 2 kali pengulangan, kemudian di tambahkan media agar sebanyak 15-20 ml dan digoyang hingga merata dan ditunggu sampai memadat. Selanjutnya
cawan petri di inkubasi selama 18-24 jam pada masing-masing temperatur tergantung jenis sporanya dan tiap cawan petri di hitung dan koloni yang di hitung
jumlahnya antara 25-250.
Gambar 2. Bagan Penghitungan Spora
1 ml SPORA 10
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
+ 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml
+ 1 ml
31 Masing-masing cawan petri diisi dengan 15-20 ml media agar dan 1 ml spora.
3.4.7. Cara Menyatakan Hasil
Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua dibelakang koma. Jika angka yang ketiga sama
dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua.
Tabel 3. Standar Penghitungan Cawan Jumlah Koloni
Per Pengenceran Standar
Penghitungan Cawan Keterangan
10
-1
10
-2
10
-3
200 23
1 20 x 10
-4
23 dan 1 25 700
125 10
1,3 x 10
-5
700250 ; 1025 Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan
jumlah antara 25 dan 250, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil dari atau sama dengan 2, tentukan
rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar 2, yang dilaporkan
hanya hasil yang terkecil.
Tabel 4. Standar Penghitungan Cawan Jumlah Koloni
Per Pengenceran Standar
Penghitungan Cawan Keterangan
10
-2
10
-3
10
-4
250 41 4 4,1 x 10
-4
Hitung rata-rata : 41000\25000=1,64 2
140 32 2 1,4 x 10
-4
Hitung rata-rata : 32000\14000=2,3 2
32
3.4.8. Pembuatan Larutan Standar Kerja
Penisilin
Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Penisilin dengan larutan dapar sampai konsentrasi 0,1 µgml.
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µgml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 µgml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 10 µgml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 1 µgml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 0,1 µgml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 0,01 µgml sebagai larutan standar kerja
Tetrasiklin
Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Tetrasiklin dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µgml.
33 Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µgml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 100 µgml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 10 µgml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 1 µgml sebagai larutan standar kerja
Aminoglikosida
Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Aminogliksida dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µgml.
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µgml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 µgml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 10 µgml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 1 µgml sebagai larutan standar kerja
34
Makrolida
Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Makrolida dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µgml.
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µgml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 µgml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 10 µgml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 1 µgml sebagai larutan standar kerja
3.4.9. Pengujian Sampel
Sebanyak 10 gram contoh masing-masing sampel daging paha, sayap, dada, hati, ginjal dan kaki bagian metatarsal dimasukkan kedalam tabung
sentrifuge, ditambahkan 20 ml larutan dapar dihomogenkan, kemudian di sentrifuge 3000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan larutan supernatannya.
Sementara itu kultur media agar disiapkan untuk masing-masing kelompok antibiotika. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan di atas permukaan kultur
media. Tiap cawan petri berisi 5 buah kertas cakram, 4 buah kertas cakram ditetesi
dengan mikro pipet steril berisi larutan sampel dan 1 buah kertas cakram ditetesi dengan larutan standar antibiotika. Selanjutnya kultur media diinkubasikan pada
suhu 30 C untuk golongan tetrasiklin 30
C, untuk golongan makrolida dan aminoglikosida pada suhu 36
C sedangkan penisilin pada suhu 55 C masing-
masing selama 16-18 jam. Pengujian sampel dilakukan sebanyak 2 kali
35 pengulangan. Setelah itu hasil uji ditentukan dengan menggunakan jangka
sorongkaliper. Sampel yang terbentuk zona hambatan diplotkan pada kertas semi logaritma kurva standar masing-masing antibiotika.
3.4.10. Pengukuran Hasil
Diamati dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong kaliper. Sampel dinyatakan
positif mengandung antibiotik apabila zona hambat yang terbentuk ≥ 2 mm dari
tepi kertas cakram. Sampel dinyatakan negatif apabila zona hambat yang terbentuk 0 – 2 mm. Karena zona hambat yang terbentuk 2 mm dianggap akibat
adanya natural inhibitor. Kontrol positif harus membentuk zona hambat 15 – 30 mm, sedangkan kontrol negatif harus tidak membentuk zona hambat.
3.4.11. Pembuatan Standar Kurva Antibiotika
Kultur media disiapkan untuk masing-masing antibiotika. Kemudian di encerkan larutan stock solution standar untuk masing-masing standar antibiotika
dengan komposisi konsentrasi bervariasi. Variasi konsentrasi untuk antibiotika oksitetrasiklina, aminoglikosida dan makrolida adalah 0,25 ; 0,5 ; 1,0 ; 2,0 dan
4,0. Sedangkan variasi konsentrasi untuk antibiotika penisilina adalah 0,01 ; 0,1 ; 0,25 dan 1 µg ml. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan diatas permukaan
kultur media. Tiap cawan petri berisi 4 buah kertas cakram Sebelum di inkubasi, kultur media dibiarkan pada suhu kamar selama 30-60 menit. Inkubasikan di
dalam inkubator, untuk oksitetrasiklin pada suhu 30 C, makrolida dan tilosin pada
suhu 36 C dan penisilin pada suhu 55
C, masing-masing selama 18-24 jam. Hasil uji ditentukan dengan menggunakan jangka sorongkaliper dan dikonfirmasi pada
kurva standar masing-masing anti biotika.
0.25 1.55
0.99 0.79
0.2 0.4
0.6 0.8
1 1.2
1.4 1.6
Zo n
a H
a m
b a
t m
m
Daging Paha
Daging Dada
Daging Sayap
Hati Ginjal
Kaki
S ampel
Penisilin Tetrasiklin
M akrolida Aminoglikosida
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengujian residu antibiotika terhadap sampel daging bagian paha, sayap, dada, hati, ginjal dan kaki ayam pedaging menggunakan metode Bio-Assay atau
Screening Test yang mengacu pada SNI 01-6366-2000 tentang batas maksimum residu dalam bahan pangan asal hewan. Hasil pengujian dapat dilihat pada tabel di
bawah ini:
Tabel 5. Rata-rata Zona Hambat Residu Antibiotika Penisillin Antara Daging Paha, Dada, Sayap, Organ Hati, Ginjal dan Kaki Ayam
Pedaging
Zona Hambat No. Sampel Jumlah
Penisilin Tetrasiklin Makrolida Aminoglikosida
1. Hati 31
1,55 ± 8,53 Negatif Negatif
Negatif 2. Ginjal
31 0,99 ± 6,34
Negatif Negatif Negatif
3. Daging Paha
31 0,25 ± 1,85
Negatif Negatif Negatif
4. Kaki
31 0,79 ± 3,77
Negatif Negatif Negatif
5. Daging Dada
31 Negatif Negatif Negatif Negatif
6. Daging Sayap 31
Negatif Negatif Negatif Negatif
Berdasarkan tabel di atas terlihat golongan antibiotika tetrasiklin, makrolida dan aminoglikosida tidak terbentuk zona hambat, sedangkan golongan penisilin
terbentuk zona hambat. Hasil rataan zona hambat pada daging paha, hati, ginjal dan kaki ayam pedaging masih berada di bawah standard SNI 01-6366-2000.
Ilustrasi dari rata-rata zona hambat seperti grafik di bawah ini:
Grafik 1. Rataan Zona Hambat Residu Antibiotika Golongan Penisilin, Tetrasiklin, Makrolida dan Aminoglikosida
37 Organ hati mempunyai rataan zona hambat yang paling besar dibandingkan
dengan lima bagian lainnya, sedangkan bagian dada dan sayap tidak ada sebaran rataan zona hambat karena nilainya adalah negatif.
Tidak ditemukannya residu antibiotika pada karkas, organ dan kaki ayam pedaging, dimungkinkan karena farmakokinetika obat pada fase farmakokinetika
yaitu, absorpsi, transpor, biotransformasi, distribusi dan ekskresi.
a. Absorpsi
Antibiotika yang diberikan secara oral masuk ke dalam lambung, kemudian di usus hancur menjadi molekul kecil dan menembus dinding usus halus.
Penyerapan obat dari usus ke sirkulasi darah melalui filtrasi, difusi atau transfor aktif, kecepatan resorpsi tergantung pada pemberian, cara pemberian dan sifat
fisikokimiawi obat. Disini kecepatan larut partikel obat dissolution rate mempunyai peranan yang penting, semakin halus obat semakin cepat larut dan
resorpsi obat. Contohnya sulfonamida dan khloramfenikol Mutchler, 1999 dan Phillips et al., 2004 .
Antibiotika yang digunakan sebagai growth promoter, daya absorbsi paling kecil oleh usus artinya antibiotika ini bekerja hanya membunuh bakteri patogen,
sehingga jenis antibiotika tersebut sama sekali tidak ada resiko terakumulasi di organ tubuh ternak. Dosis penggunaannya sangat kecil yaitu antara 1 – 2 ppm atau
1 – 2 kgton pakan, sifat antibiotika harus mudah terdegradasi oleh alam, sesuai Surat Keputusan Menteri Pertanian nomor 806KptsTN.2601294 tentang
klasifikasi obat hewan, bahwa antibiotika yang digunakan tidak memiliki waktu paruh atau waktu henti withdrawal time obat Anonimus, 1991.
b. Transpor