III. METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - Oktober 2011 di Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi,
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gunting bedah, pinset, mikrofilter, spoit 10 mL dan 1 mL, gelas objek, kaca penutup, cawan petri,
hemositometer, mikropipet, gelas ukur, erlenmeyer, gelas beaker, tabung sentrifus, timbangan digital, inkubator, mikroskop dan biosafety cabinet.
Bahan yang digunakan antara lain tulang tikus Rattus norvegicus umur 4 minggu, medium kultur mDMEM [Dubelcco’s Modified Eagle Medium DMEM
yang diberi tambahan asam amino non-essensial AANE; Sigma 10, Newborn Calf Serum NBCS 10, sodium bicarbonat NaHCO
3
3,7 µgmL, gentamycin 50 µgmL, insulin transferrin selenium ITS 1µlmL], mPBS [phosphate buffered
saline PBS yang diberi tambahan NBCS 0.1 dan gentamycin 50 µgmL], Dexamethason 10
-8
M, ekstrak Cissus quadrangula Salisb. dan pewarna Hematoksilin Eosin HE.
3.3 Metode
3.3.1. Ekstrak Batang Sipatah-patah Cissus quadrangula Salisb. Ekstrak batang sipatah-patah CQ yang dipakai pada penelitian ini
merupakan ekstrak siap pakai yang berasal dari Laboratorium Farmasi FKH IPB yang dibuat menggunakan metode maserasi etanol.
3.3.2. Persiapan Kultur Sel Tulang Sebelum digunakan, cawan petri Corning
®
dilapisi dengan 1 mL gelatin 0.1 dan didiamkan pada suhu kamar selama 1 jam. Setelah satu jam, gelatin
dibuang dan dicuci dengan PBS kemudian didiamkan selama 5 menit. Cawan petri diisi dengan mDMEM yang mengandung dexamethason 10
-8
M, CQ dosis
0.3 mgmL, 0.6 mgmL, dan 1.2 mgmL sebanyak 2 mL kemudian diinkubasi selama minimal satu jam ke dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C. 3.3.3. Isolasi dan Kultur Sel Tulang
Sel tulang diisolasi dari tulang femur, tibia dan fibula tikus Rattus norvegicus umur empat minggu. Tulang dicacah hingga halus dan disuspensi di
dalam mPBS menggunakan spuit 1 cc. Suspensi tulang disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama 10 menit, pencucian ini dilakukan dengan mPBS
sebanyak empat kali dan mDMEM sebanyak satu kali. Sebelum dikultur, jumlah sel dihitung menggunakan hemositometer. Sel dengan konsentrasi 3 x 10
4
selmL dalam 100 µl dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi medium perlakuan
sebanyak 2 mL. Setiap kultur dilakukan rangkap dua, terdiri dari cawan petri yang diberi dan tidak diberi kaca penutup pada dasar cawan petri tersebut. Cawan
petri yang tidak diberi kaca penutup digunakan untuk menghitung proliferasi sel sedangkan cawan petri yang diberi kaca penutup digunakan untuk pewarnaan HE.
Kultur diinkubasi di dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C. Medium mDMEM dan perlakuan diganti setiap 2 hari sekali sebanyak 2 mL setiap
penggantian. Kultur dilakukan sampai hari ketujuh.
3.4. Evaluasi Hasil Kultur Sel Tulang
Kategori