Sedangkan Population Doubling Time PDT dihitung menggunakan rumus Davis 2011:
3.4.2. Identifikasi Diferensiasi Osteoblas dan Osteosit
Identifikasi jumlah dan diameter sel-sel tulang yang dikultur yakni dengan menggunakan teknik pewarmaan Hematoksilin Eosin. Kultur sel yang
ditumbuhkan di atas cover glass dicuci dengan PBS kemudian difiksasi dalam larutan buffer paraformaldehid 4. Kultur yang telah difiksasi dan siap diwarnai
terlebih dahulu dimasukkan ke dalam alkohol 70 selama 5 menit, kemudian alkohol 50 selama 5 menit, aquades 10 menit sebanyak 3 kali perendaman
sebagai rehidrasi. Setelah itu direndam dalam hematoksilin selama 10 menit dan dibilas dengan aquades selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan perendaman dalam
eosin selama 5 menit, dibilas dengan aquades selama 5 menit, dan dilakukan dehidrasi bertingkat menggunakan alkohol. Setelah itu dilanjutkan dengan
perendaman pada xylol dua kali ulangan masing-masing selama 10 menit, kemudian cover glass ditempelkan dengan object glass menggunakan entelan dan
diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 untuk dihitung jumlah sel- sel tulang yang ada. Penghitungan dilakukan pada 16 lapang pandang kemudian
dipersentasekan dengan total sel yang dihitung. Perhitungan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dan kemudian dirata-ratakan. Pada penghitungan diameter
dilakukan dengan menggunakan mikrometer Eyepiece dan diamati dengan mikroskop pada pembesaran 40 x 10. Penghitungan diameter dilakukan pada 20
osteoblas dan 20 osteosit yang ada pada masing-masing perlakuan. Perhitungan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dan kemudian dirata-ratakan.
3.5. Rancangan Percobaan
Terdapat lima kelompok perlakuan yang terdiri dari kontrol negatif mDMEM, kontrol positif mDMEM + dexamethason 10
-8
M, pemberian ekstrak batang Sipatah-patah Cissus quadrangula Salisb. atau CQ yakni CQ 0.3
1 PDT hari =
log jumlah sel akhir-log jumlah sel awal x 3,32 waktu
mDMEM + CQ 0.3 mgmL, CQ 0.6 mDMEM + CQ 0.6 mgmL, dan CQ 1.2 mDMEM + CQ 1.2 mgmL. Masing-masing kelompok perlakuan terdiri atas
satu cawan yang dilapisi cover glass untuk pewarnaan HE dan satu cawan tanpa cover glass untuk menghitung Population Doubling Time PDT. Masing-masing
perlakuan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Parameter yang diamati yaitu PDT, jumlah osteoblas dan osteosit, serta diameter osteoblas dan osteosit. Data
PDT, jumlah osteoblas dan osteosit, serta diameter osteoblas dan osteosit dianalisis menggunakan uji statistik ANOVA dan dilanjutkan dengan uji statistik
Duncan.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Tingkat Proliferasi Berdasarkan Population Doubling Time PDT
Population Doubling Time PDT adalah waktu yang diperlukan oleh populasi sel untuk menjadikan jumlahnya dua kali dari jumlah semula. Semakin
kecil nilai PDT menandakan semakin cepat proliferasi sel yang terjadi. Hasil PDT kultur sel tulang yang diberi perlakuan ekstrak batang sipatah-patah Cissus
quadrangula Salisb.. dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Proliferation Doubling Time PDT sel tulang pada kultur yang diberi
ekstrak batang sipatah-patah Cissus quadrangula Salisb. hari Perlakuan
PDT Kontrol positif
2.34 ± 0.22
a
Kontrol negatif 3.57 ± 0.40
b
CQ 0.3 2.18 ± 0.12
a
CQ 0.6 2.39 ± 0.25
a
CQ 1.2 2.55 ± 0.35
a
Ket: Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan adanya perbedaan
nyata P0,05. Kontrol negatif mDMEM; kontrol positif mDMEM+Dexamethason 10
-8
M; ekstrak batang Sipatah-patah Cissus quadrangula Salisb. atau CQ CQ 0.3 mDMEM+CQ 0.3 mgmL; CQ 0.6 mDMEM+0.6 mgmL; CQ 0.3 mDMEM+CQ 1.2
mgmL.
Nilai PDT pada kontrol negatif dan kontrol positif adalah 3.57 ± 0.40 hari dan 2.34 ± 0.22hari, sedangkan nilai PDT pada pemberian ekstrak CQ 0.3, CQ
0.6, dan CQ 1.2 masing-masing adalah 2.18 ± 0.12 hari, 2.39 ± 0.25 hari, dan 2.55
± 0.35 hari. Menurut Binderman et al. 1974, sel tulang memiliki PDT sekitar 2-4 hari. Pemberian ekstrak batang tanaman sipatah-patah Cissus quadrangula
Salisb. pada kultur sel tulang dengan konsentrasi CQ 0.3, CQ 0.6, dan CQ 1.2 menurunkan nilai PDT jika dibandingkan dengan kontrol negatif P0.05. Hal
ini sejalan dengan kontrol positif yang juga menunjukkan terjadinya penurunan nilai PDT. Nilai PDT yang semakin kecil menandakan pemberian ekstrak dapat
meningkatkan terjadinya proliferasi pada sel tulang yang dikultur. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Potu et al. 2009, penambahan ekstrak
Cissus quadrangulais Linn. pada kultur sumsum tulang menyebabkan terjadinya proliferasi bone marrow mesenkhimal stem cell MSCs.
Salah satu komponen yang terkandung dalam ekstrak batang sipatah-patah adalah fitoestrogen Sabri 2011. Senyawa fitoestrogen tersebut antara lain
isoflavon, lignin, coumestan, triterpen, asiklik, dan glicoides Jainu dan Devi 2006. Isoflavon memiliki kemampuan dalam mengikat reseptor estrogen
β dalam osteoblas dan menstimulasi proliferasi osteoblas Yamaguchi 2002. Selain itu,
menurut Rachman et al. 1996 fitoestrogen mampu meningkatkan produksi insulin-like growt factor IGF-1 yang memiliki hubungan positif terhadap
pembentukan massa tulang. IGF-1 merupakan protein yang menyerupai hormon insulin endogen dan berperan penting dalam pertumbuhan dan metabolisme sel.
IGF-1 juga berperan dalam proliferasi sel dan menghambat kematian sel LeRoith et al. 1992. Kandungan fitoestrogen yang terdapat dalam ekstrak batang sipatah-
patah Cissus quadrangula Salisb. dipercaya dapat meningkatkan proliferasi sel tulang yang dikultur.
4.2 Diferensiasi Sel Tulang
