0.3 mgmL, 0.6 mgmL, dan 1.2 mgmL sebanyak 2 mL kemudian diinkubasi selama minimal satu jam ke dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C. 3.3.3. Isolasi dan Kultur Sel Tulang
Sel tulang diisolasi dari tulang femur, tibia dan fibula tikus Rattus norvegicus umur empat minggu. Tulang dicacah hingga halus dan disuspensi di
dalam mPBS menggunakan spuit 1 cc. Suspensi tulang disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama 10 menit, pencucian ini dilakukan dengan mPBS
sebanyak empat kali dan mDMEM sebanyak satu kali. Sebelum dikultur, jumlah sel dihitung menggunakan hemositometer. Sel dengan konsentrasi 3 x 10
4
selmL dalam 100 µl dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi medium perlakuan
sebanyak 2 mL. Setiap kultur dilakukan rangkap dua, terdiri dari cawan petri yang diberi dan tidak diberi kaca penutup pada dasar cawan petri tersebut. Cawan
petri yang tidak diberi kaca penutup digunakan untuk menghitung proliferasi sel sedangkan cawan petri yang diberi kaca penutup digunakan untuk pewarnaan HE.
Kultur diinkubasi di dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C. Medium mDMEM dan perlakuan diganti setiap 2 hari sekali sebanyak 2 mL setiap
penggantian. Kultur dilakukan sampai hari ketujuh.
3.4. Evaluasi Hasil Kultur Sel Tulang
3.4.1. Tingkat Proliferasi population doubling time
Tingkat proliferasi ditentukan dengan menghitung jumlah sel pada saat sebelum dikultur dan setelah kultur hari ketujuh. Pada hari ketujuh medium
dibuang lalu sel hasil kultur dicuci dengan PBS kemudian dimasukkan larutan tripsin 0.1 dalam mPBS sebanyak 1 mL. Sel diinkubasi selama 5 menit sampai
sel terlihat soliter dan diamati di bawah mikroskop. Pemipetan berulang dapat dilakukan untuk mempermudah disosiasi sel. Sel yang telah terdisosiasi
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 200 g di dalam mPBS. Selanjutnya sel dihitung menggunakan hemositometer Improved Neubauer
dengan perhitungan : Total sel selmL = jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengenceran x 10
4
Sedangkan Population Doubling Time PDT dihitung menggunakan rumus Davis 2011:
3.4.2. Identifikasi Diferensiasi Osteoblas dan Osteosit
Identifikasi jumlah dan diameter sel-sel tulang yang dikultur yakni dengan menggunakan teknik pewarmaan Hematoksilin Eosin. Kultur sel yang
ditumbuhkan di atas cover glass dicuci dengan PBS kemudian difiksasi dalam larutan buffer paraformaldehid 4. Kultur yang telah difiksasi dan siap diwarnai
terlebih dahulu dimasukkan ke dalam alkohol 70 selama 5 menit, kemudian alkohol 50 selama 5 menit, aquades 10 menit sebanyak 3 kali perendaman
sebagai rehidrasi. Setelah itu direndam dalam hematoksilin selama 10 menit dan dibilas dengan aquades selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan perendaman dalam
eosin selama 5 menit, dibilas dengan aquades selama 5 menit, dan dilakukan dehidrasi bertingkat menggunakan alkohol. Setelah itu dilanjutkan dengan
perendaman pada xylol dua kali ulangan masing-masing selama 10 menit, kemudian cover glass ditempelkan dengan object glass menggunakan entelan dan
diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 untuk dihitung jumlah sel- sel tulang yang ada. Penghitungan dilakukan pada 16 lapang pandang kemudian
dipersentasekan dengan total sel yang dihitung. Perhitungan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dan kemudian dirata-ratakan. Pada penghitungan diameter
dilakukan dengan menggunakan mikrometer Eyepiece dan diamati dengan mikroskop pada pembesaran 40 x 10. Penghitungan diameter dilakukan pada 20
osteoblas dan 20 osteosit yang ada pada masing-masing perlakuan. Perhitungan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dan kemudian dirata-ratakan.
3.5. Rancangan Percobaan
