spektrofotometer pada λ = 595 nm. Konsentrasi protein sampel diukur dengan
cara yang sama. Tabel komposisi volume larutan dalam pembuatan larutan standar konsentrasi 0-0,01 mgml dari larutan stok BSA konsentrasi 2 mgml disajikan
pada Tabel 2. Tabel 2 Pembuatan larutan standar BSA konsentrasi 0-0,01 mgml
Konsentrasi BSA mgml Volume BSA ml
Volume akuades ml 0,000
0,400 0.02
0,080 0,320
0,04 0,160
0,240 0,06
0,240 0,160
0,08 0,320
0,080 0,01
0,400 0,000
3.4.8 Penentuan aktivitas enzim Walter 1988
Aktivitas enzim diukur menggunakan metode Walter 1988 dimodifikasi. Metode analisis aktivitas enzim protease dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Metode analisis aktivitas enzim protease Pereaksi
Contoh µl Blanko µl
Standar µl Buffer Tris-Cl pH 8, 0,2 M
250 250
250 Kasein 1
250 250
250 Enzim
50 -
- H
2
O steril -
50 -
Tirosin standar 5 mM 50
- 50
Inkubasi selama 10 menit pada suhu 37
°
C TCA 0,1 mol l
500 500
500 Enzim
- 50
50 H
2
0 steril 50
- -
Inkubasi selama 10 menit pada suhu 37
°
C dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit
Filtrat 375
375 375
Na
2
CO
3
0,5 mol l 1250
1250 1250
Pereaksi folin 250
250 250
Inkubasi selama 20 menit pada suhu 37
°
C, kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm
Sumber: Walter 1988 Unit aktivitas enzim adalah jumlah enzim yang menghasilkan produk yang
setara dengan 1 µmol tirosin per menit pada suhu 37
°
C dan pH 8. Cara menghitung unit aktivitas enzim adalah sebagai berikut, setiap yang akan dihitung
unit aktivitasnya mempunyai nilai absorban untuk contoh, blanko, dan standar
masing-masing, dengan menggunakan rumus dibawah ini dapat dihitung unit aktivitas dari enzim.
U = A
sp
− A
bl
A
st
− A
bl
× P × 1
T Dimana:
U = Unit aktivitas protease per ml per menit U ml
-1
menit
-1
A
sp
= Nilai absorbansi contoh A
st
= Nilai absorbansi standard A
bl
= Nilai absorbansi blanko P
= Faktor pengenceran T
= waktu inkubasi menit
3.4.9 Penentuan tingkat kemurnian enzim protease dengan sodium dodecyl
sulphate-poly acrylamide
gel electrophoresis
SDS-PAGE Laemmli 1970
Berat molekul protease hasil pemurnian dianalisis meenggunakan SDS-page Laemmli 1970. Marker yang digunakan adalah
β-galactosidase 116 kDa, BSA 66,2 kDa, Ovalbumin 45 kDa, Lactate dehydrogenase 35 kDa, REas Bsp981
25 kDa, β-lactoglobulin 18,4 kDa, dan Lysozime 14,4 kDa.
Tahapan kerja yang dilakukan dalam analisis SDS-PAGE meliputi penyiapan gel pemisah dan penahan, penyiapan sampel dan loading, kondisi
running, pewarnaan gel, dan pelunturan warna. Tahapan awal SDS-PAGE adalah adalah penyiapan gel pemisah dan penahan. Komposisi bahan untuk membuat gel
pemisah maupun gel penahan tertera pada Lampiran 2. Pada proses ini digunakan
gel pemisah 10 dan gel penahan 4, komposisi gel SDS-PAGE dapat dilihat pada Tabel 4.
Selanjutnya adalah tahapan preparasi sampel dan loading. Sampel protein yang akan dianalisis dan molecular weight marker, dicampur dengan
buffer sampel dengan perbandingan 1:1. Campuran ini dipanaskan dalam air mendidiih selama 3-5 menit kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel
elektroforesis dengan volume tertentu. Agar terbentuk band yang baik, maka volume sampel yang dimasukkan ke dalam sumur diusahakan sama banyak.
Setelah sampel dimasukkan maka perangkat elektroforesis dijalankan. Kondisi running yang digunakan adalah pada arus 24 mA - 10 mA dan voltage konstan
70 Volt selama empat jam. Elektroforesis diakhiri ketika pewarna sampel mencapai batas 0,5 cm hingga 1 cm dari bagian bawah gel. Setelah elektroforesis
berakhir, gel diwarnai menggunakan pewarnaan silver sehingga diperoleh pita protein berwarna cokelat dengan latar bening.
Tabel 4 Komposisi gel SDS-PAGE Bahan
Separating gel 10 Stacking gel 4
Larutan A Larutan B
Larutan C Akuabides
APS 10 TEMED
2,7 ml 2,5 ml
- 4,8 ml
50 µl 5,0 µl
0,67 ml -
1,25 ml 3,0 ml
50 µl 5,0 µl
Keterangan: Larutan A terdiri dari
: 29,2 gram akrilamid, dan 0,8 gram bis-akrilamid Larutan B terdiri dari
: 75 ml Tris HCl 2 M pH 8,8, dan 4 ml SDS 10 Larutan C terdiri dari
: 50 ml Tris HCl 1 M pH 6,8, dan 4 ml SDS 10 Tahapan pewarnaan dilakukan dengan cara, mula-mula gel direndam selama
semalam pada suhu ruang di dalam larutan fiksasi sambil diagitasi pelan-pelan. Setelah itu gel dicuci dengan larutan pencuci selama 20 detik, proses ini diulang
sebanyak tiga kali. Gel yang telah dicuci kemudian dibilas dengan akuades bebas ion selama 10 detik lalu gel direndam dalam larutan sensitizen Na
2
S
2
O
3
0,001 M selama satu menit. Gel dibilas dengan akuades bebas ion selama 20 detik, proses
ini diulang sebanyak tiga kali. Kemudian gel diinkubasi di lemari es dengan 0,1 AgNO
3
selama 20 menit. Setelah diinkubasi, gel dicuci dengan akuades bebas ion selama 20 detik sebanyak dua kali. Gel dipindahkan ke wadah yang lain kemudian
dicuci dengan akuades bebas ion selama 10 detik. Gel direndam ke dalam larutan developing gel terdiri dari 6 gram N
2
CO
3
, 50 ml formalin dan 2 ml Na
2
S
2
O
3
hingga pewarnaan cukup. Setelah pewarnaan cukup, ditambahkan larutan stop solution asam asetat glasial 12 ke dalam wadah dan gel dibiarkan terendam
selama lima menit. Kemudian gel dicuci dengan akuades bebas ion selama 5 menit. Komposisi bahan dan cara membuat larutan yang digunakan untuk proses
pewarnaan silver dapat dilihat pada Lampiran 3.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Komposisi Kimia Jeroan Ikan Tuna
