Konsentrasi 20 ppm Konsentrasi 40 ppm Konsentrasi 60 ppm Alkaloida Flavonoida Tanin Terpenoida Saponin

65 65 Lampiran 7. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem. Perhitungan Peredaman Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning

1. Konsentrasi 20 ppm

2. Konsentrasi 40 ppm

3. Konsentrasi 60 ppm

4. Konsentrasi 80 ppm

Peredaman radikal ekstrak metanol daun tumbuhan loning Sampel Absorbansi Peredaman Blanko 0,942 20 0,469 50,2123 40 0,419 55,5201 60 0,379 59,7664 80 0,291 69,1082 Universitas Sumatera Utara 66 66 Perhitungan Nilai IC 50 Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem. X y xy x 2 0,00 0,00 20 50,2123 1004,246 400 40 55,5201 2220,804 1600 60 59,7664 3585,984 3600 80 69,1082 5528,656 6400 ∑x = 200 ∑y = 234,607 ∑xy = 12339,69 ∑x 2 = 12000 Dimana : x = Konsentrasi y = Peredaman = 0,30467 Universitas Sumatera Utara 67 67 = 43,41825 Jadi persamaan garis regresi Y = 0,304x + 43,41 Nilai IC 50 : 50 = 0,304x + 43,41 0,304x = 50 – 43,41 0,304x = 6,59 x = 21,67 IC 50 = 21,67 mgL = 21,67 ppm Universitas Sumatera Utara 68 68 Lampiran 8. Hasil Perhitungan Kadar Air dan Kadar Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem. Kadar air serbuk daun tumbuhan loning diperoleh dari perhitungan sebagai berikut : Berat sampel = 2 gram Berat setelah pemanasan = 1,810 gram Kehilangan bobot = 2 gram – 1,810 gram = 0,19 gram Kadar ekstrak metanol diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut : Berat sampel kering = 200 gram Berat ekstrak = 20,75 gram Universitas Sumatera Utara 69 69 Lampiran 9. Pembuatan larutan DPPH 0,3 mM Universitas Sumatera Utara 54 54 DAFTAR PUSTAKA Agoes, G. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung : Penerbit ITB Press. Apak, R. 2007. Comparative Evaluation of Various Total Antioxidant Capacity Assay Applied to Phenolic Compounds with The CUPPRAC Assay . Molecules 12:1496-1547 Ajizah, A. 2004 . Sensitivitas Salmonella Tyhimurium Terhadap Ekstrak Daun Psidium Guajava L. Jurnal Bioscientiae. Volume 1. Nomor 1. Halaman 36. Andlauer,W. and Furst,P. 2001.Food Research International. Germany : Institute For Biological Chemistry And Nutrition, University of Honenheim Artini, P.E.U.D., Astuti,K.W. dan Warditiani, N.K. 2013. Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Rimpang Bangle Zingiber purpureum Roxb.. volume 2.Nomor 4. Jimbaran-Bali: Universitas Udayana Astarina, N.W.G., Astuti, K.W. dan Warditiani, N.K. 2013. Skrining Fitokimia Ekstrak Rimpang Bangle Zingiber purpureum Roxb.. Volume 2.Nomor 4. Jimbaran-Bali : Universitas Udayana Bintang, M. 2010. Biokimia-Teknik Penelitian. Jakarta : Erlangga Buckle, K.A. 2007. Ilmu Pangan. Penerjemah Hari Purnomo dan Adiono. Jakarta:Universitas Indonesia. Candra,R.A. 2012. Isolasi dan Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Alkaloid dari Ekstrak Daun Phoebe declinata Nees. [Skripsi]. Depok: Universitas Indonesia, Program Sarjana Clinical and Laboratory Standars Institue, 2007. Performance Standars for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing; Seventeenth Informational Supplement . M100-S17, Vol.27, No.3 Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi. Padang : Andalas University Press Dalimartha, S. 2006. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jilid 4. Puspaswara. Jakarta. Depkes RI. 2000 . Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat . Cetakan Pertama. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat Makanan. Universitas Sumatera Utara 55 55 Erawati. 2002. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Garciniadaedalanthera Pierre Dengan Metode DPPH 1,1-Difenil Pikrilhidrazil dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia dari Fraksi Paling Aktif , Skripsi Sarjana Farmasi Universitas Indonesia. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Umum. Gaman,P.M. 1992. Ilmu Pangan. Edisi Kedua. Yogyakarta : Gajah Mada University Press. Harborne, J.B. 2003. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Edisi II . Institut Teknologi Bandung. Bandung Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan . Penerjamah : Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Edisi Ketiga. Bandung : ITB Press. Irianto,K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung: Yrama Widya. Jawetz., Melnick. dan Adelberg’s. 1995. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20, Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jayakumari, S.,Ravichandiran,V and Rao, N. 2014. Antimocrobial Activity of Pisonia grandis R.Br. Leaf Extract and Its Fraction. Vol 3. India : Department of Pharmacognosy, School of Pharmaceuticl Sciences, VELS University Pallavaram. Kosasih, E. N. 2004. Peran Antioksidan Pada Lanjut Usia. Jakarta : Pusat Kajian Nasional Majalah Lanjut Usia. Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung : ITB. Molyneux, P. 2004. The Use of Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl DPPH for Estimating Antioxidant Activity, Journal Science of Technology . Pokornya, J.N. Yanishlieva and N.Gordon. 2001. Antioxidant in Food. Woodhead Publishing Limited : England. Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Yogyakarta: Penerbit Erlangga Purwantoro, R.S., Siregar, H.M., Sudarmono. dan Praptiwi. 2010. Uji Antibakteri Lasianthus Rubiceae Sebagai Tumbuhan Berkhasiat Obat Dan Upaya Perbanyakannya. Bogor : Buletin Kebun Raya volume 13, No. 2. Rahayu, P. Winiati. 2000. Aktivitas Antimikroba Bumbu Masakan Tradisional Hasil Olahan Industri Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak . Vol 112. Buletin Teknologi dan Industri Pangan. Universitas Sumatera Utara 56 56 Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB. Setyowati, W.A.E., Sri Retno, D.A., Ashadi., Bakti, M., Cici Putri, R. 2014. Skrining Fitokimia dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Metanol Kulit Durian Durio zibethinus Murr. Varietas Petruk. Surakarta: Universitas Sebelas Maret Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia dalam Farmasi. Bandung : Penerbit ITB Subeki. 1998. Pengaruh Cara Pemasakan Terhadap Kandungan Antioksidan Beberapa macam Sayuran Serta Daya Serap dan Retensinya pada Tikus Percobaan . Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Syukur, C. 2001. Budidaya Tanaman Obat Komersial. Jakarta : Penebar Swadaya Tortora, G.J. 2001. Microbiology an Introduction. Edisi Ketujuh. New York : M Addison Wesley Longman, Inc. Halaman 86-88. Viljanen, K. 2005. Protein Oxidation and Protein-Lipid Interactions in Different Food Models in the Presence of Berry Phenolics. [Dissertation]. Finland : University of Helsinki, Department of Applied Chemistry and Microbiology Widodo, W. 2005. Tanaman Beracun dalam Kehidupan Ternak. Malang : Penerbit Universitas Muhammadiah Malang Press Widyastuti, N. 2010. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman , Skripsi Sarjana Sains Institut Pertanian Bogor. Universitas Sumatera Utara 27 27

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: Nama Alat Merek 1. Autoklaf Fiesher Scientific 2. Rotary evaporator Buchi 3. Spektrofotometer UV-VIS SP-300 4. Incubator fiber scientific 5. Neraca Analitik Sartorius 6. Oven fischer scientific 7. Pipet Volume Pyrex 8. Bunsen - 9. Pipet mikro - 10. Blender - 11. Bola Karet - 12. Cawan petri - 13. Corong - 14. Penangas Air - 15. Statif dan Klem - 16. Gelas Erlenmeyer Pyrex 17. Gelas Beaker Pyrex 18. Desikator - 19. Gelas Ukur Pyrex 20. Tabung reaksi - 21. Batang pengaduk - 22. Jangka sorong - 23. Vortex - Universitas Sumatera Utara 28 28

3.2 Bahan-Bahan

Sedangkan bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: Bahan Merek 1. Daun tumbuhan Loning - 2. Metanol - 3. Etil asetat - 4. Etanol p.a. Merck 5. Aquadest - 6. FeCl 3 5 - 7. CeSO 4 dalam H 2 SO 4 10 - 8. Pereaksi Wagner - 9. Pereaksi Maeyer - 10. Pereaksi Bouchardat - 11. Pereaksi Dragendorf - 12. DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazil p.a. Aldrich 13. DMSO dimetilsulfoksida p.a. Fisons 14. Mueller Hinton Agar MHA - 15. Nutrient Broth NB Merck 16. Nutrient Agar NA Merck 17. Bakteri Staphylococcus aureus - 18. Bakteri Escherichia coli - 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daun tumbuhan loning yang diperoleh dari Desa Lau Baleng, Kabupaten Karo. Daun tumbuhan loning dipisahkan dari batangnya dan dikeringkan dalam ruangan sampai kering kemudian dihaluskan dengan blender kemudian ditentukan kadar airnya. Universitas Sumatera Utara 29 29 3.3.2 Pembuatan Ekstrak Metanol dari Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst. Seem. Daun tumbuhan loning dipisahkan dari batangnya, lalu dikeringkan dalam ruangan sampai kering, setelah kering diblender. Kemudian diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol, selama 2x24 jam, dilakukan beberapa kali pengulangan hingga larutan berwarna jernih. Kemudian dirotarievaporator dan filtratnya yang dihasilkan diuapkan diatas penangas air sampai dihasilkan ekstrak kering. Ekstrak kering yang dihasilkan diuji skrining fitokimia, aktivitas antioksidan dengan menggunakan DPPH 2,2-diphenyl-1-pycril-hydrazil dan antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan menggunakan metode difusi agar.

3.3.3 Uji Skrining Fitokimia

1. Alkaloida

Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam 4 tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Wagner, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloida. Tabung II ditetesi pereaksi Maeyer, jika terbentuk endapan putih, maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan cokelat, maka positif mengandung alkaloida dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloida.

2. Flavonoida

Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam 2 tabung reaksi. Tabung I ditetesi NaOH 10, jika terbentuk larutan warna biru violet maka positif mengandung flavonoida. Tabung II ditambah serbuk Mg dan HCl pekat, jika terbentuk larutan warna jingga maka positif mengandung flavonoida.

3. Tanin

Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan FeCl 3 5. Jika terbentuk larutan warna biru kehitaman maka positif mengandung tanin. Universitas Sumatera Utara 30 30

4. Terpenoida

Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan CeSO 4 1 dalam H 2 SO 4 10. Jika terbentuk endapan warna merah kecokelatan maka positif mengandung terpenoida.

5. Saponin

Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing ditambah 10 ml aquades, kemudian dikocok kuat-kuat. Jika muncul busa yang stabil maka positif mengandung saponin.

3.3.4 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl- hydrazil

3.3.4.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mM

Larutan DPPH 0,3 mM dibuat dengan melarutkan 11,85 mg serbuk DPPH dalam etanol p.a dalam labu takar 100 mL, kemudian dihomogenkan.

3.3.4.2 Pembuatan Variasi konsentrasi

Ekstrak metanol dibuat larutan induk 1000 ppm, dengan melarutkan 0,025 g ekstrak metanol dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian dari larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm. Kemudian dari larutan 100 ppm dibuat lagi variasi konsentrasi 20, 40, 60, dan 80 ppm.

3.2.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan a. Larutan Blanko

Sebanyak 1 ml larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan 2,5 ml etanol p.a. Dihomogenkan dalam tabung reaksi dan dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap. Setelah itu diukur absorbansi dengan panjang gelombang maksimum 515 nm.

b. Uji Aktivitas Antioksidan Sampel

Sebanyak 1 ml larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan 2,5 ml ekstrak metanol dengan konsentrasi 20 ppm, dihomogenkan dalam tabung reaksi dan dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap. Universitas Sumatera Utara 31 31 Setelah itu diukur absorbansi dengan panjang gelombang maksimum 515 nm.

3.3.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol

3.3.5.1 Pembuatan Media Nutrien Agar NA Miring Dan Sub Kultur Bakteri

Dimasukkan 7 g media NA ke dalam gelas erlenmeyer, dilarutkan dengan 250 ml aquadest yang diikuti dengan pemanasan dan pengadukan, lalu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Kemudian dituangkan kedalam empat tabung reaksi sebanyak 3 ml dibiarkan memadat pada posisi miring membentuk sudut 30 -45 C. Diambil biakan bakteri Staphylococcus aureus dan Eschericia coli dari strain utama dengan jarum ose lalu digoreskan pada media NA yang telah memadat. Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35 C.

3.3.5.2 Pembuatan Media Muller Hinton Agar MHA

Dimasukkan 19 g media MHA ke dalam gelas erlenmeyer, dilarutkan dengan 500 ml aquadest yang diikuti dengan pemanasan dan pengadukan, lalu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.

3.2.5.3 Pembuatan Media Nutrient Broth NB

Sebanyak 3,25 g media NB dilarutkan dengan 250 ml aquades dalam erlemenyer dan dipanaskan hingga semua larut, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.

3.3.5.4 Pembuatan Inokulum Bakteri

Dimasukkan 10 ml media nutrient broth NB steril dalam tabung reaksi diambil koloni bakteri Staphylococcus aureus dari stok kultur bakteri dengan jarum ose, disuspensikan kedalam nutrien broth dan diinkubasikan selama 2-3 jam pada suhu 35 o C, kemudian dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar Mcfarland. Dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Eschericia coli. Universitas Sumatera Utara 32 32

3.3.5.5 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol

Dimasukkan 0,1 ml inokulum bakteri Staphylococcus aureus kedalam cawan petri kemudian ditambahkan 15 ml media MHA dengan suhu 45 -50 C dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan masing-masing sampel yang telah berisi bakteri dan diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam dalam inkubator. Setelah itu diukur zona bening yang ada disekitar kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong. Dilakukan perlakuan yang sama untuk inokulum dari bakteri Eschericia coli untuk konsentrasi 100,200,300,400,500 mgml.

3.3.5.6 Pembuatan Variasi Konsentrasi

Dibuat larutan dengan konsentrasi 500 mgml dengan cara melarutkan 500 mg ekstrak metanol dalam 1 ml DMSO didalam botol vial, kemudian diencerkan menjadi 400 mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 500 mgml sebanyak 0,8 ml ditambah dengan 0,2 ml DMSO,kemudian diencerkan menjadi 300 mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 400 mgml sebanyak 0,75 ml ditambah dengan 0,25 ml DMSO,kemudian diencerkan menjadi 200 mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 300 mgml sebanyak 0,67 ml ditambah dengan 0,33 ml DMSO,kemudian diencerkan kembali menjadi 100 mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 200 mgml sebanyak 0,5 ml ditambah dengan 0,5 ml DMSO. Universitas Sumatera Utara 33 33 Ekstrak Metanol Daun Loning dimasukkan kedalam tabung reaksi tabung I + pereaksi Wagner tabung II + pereaksi Maeyer tabung III + pereaksi Dragendorf tabungIV + pereaksi Bouchardat tabung I + NaOH 10 tabung II + logam Mg + HCl p ditambahkan FeCl 3 5 ditambahkan CeSO 4 1 dalam H 2 SO 4 10 ditambahkan aquadest dikocok kuat-kuat Alkaloida Flavonoida Tanin Terpenoida Saponin 3.4 Bagan Penelitian 3.4.1 Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem. Universitas Sumatera Utara 34 34 serbuk daun tumbuhan loning ditimbang sebanyak 200 g serbuk daun tumbuhan loning sebanyak 200 g dimaserasi dengan 2 liter metanol selama 2x24 jam disaring dirotarievaporator hingga dihasilkan filtrat dipekatkan diatas penangas air ekstrak metanol daun tumbuhan loning

3.4.2 Ekstraksi Serbuk Daun Tumbuhan Loning dengan Pelarut Metanol

Universitas Sumatera Utara 35 35 0,025 g Ekstrak Metanol Daun Loning dimasukkan kedalam labu takar 25 ml ditambahkan etanol p.a sampai garis batas dihomogenkan 25 ml larutan 1000 ppm dipipet sebanyak 5 ml dimasukkan kedalam labu takar 50 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis batas dihomogenkan 50 ml larutan 100 ppm dibuat variasi 20, 40, 60, 80 ppm 25 ml larutan 20 ppm 25 ml larutan 40 ppm 25 ml larutan 60 ppm 25 ml larutan 80 ppm dipipet 5 ml dengan pipet volume dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis batas dihomogenkan dipipet 10 ml dengan pipet volume dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis batas dihomogenkan dipipet 15 ml dengan pipet volume dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis batas dihomogenkan dihomogenkan ditambahkan etanol p.a hingga garis batas dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dipipet 20 ml dengan pipet volume 3.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem.

1. Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning