65
65
Lampiran 7. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem.
Perhitungan Peredaman Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning
1. Konsentrasi 20 ppm
2. Konsentrasi 40 ppm
3. Konsentrasi 60 ppm
4. Konsentrasi 80 ppm
Peredaman radikal ekstrak metanol daun tumbuhan loning Sampel
Absorbansi Peredaman
Blanko 0,942
20 0,469
50,2123 40
0,419 55,5201
60 0,379
59,7664 80
0,291 69,1082
Universitas Sumatera Utara
66
66
Perhitungan Nilai IC
50
Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem.
X y
xy x
2
0,00 0,00
20 50,2123
1004,246 400
40 55,5201
2220,804 1600
60 59,7664
3585,984 3600
80 69,1082
5528,656 6400
∑x = 200 ∑y = 234,607
∑xy = 12339,69 ∑x
2
= 12000
Dimana : x = Konsentrasi y = Peredaman
= 0,30467
Universitas Sumatera Utara
67
67
= 43,41825
Jadi persamaan garis regresi Y = 0,304x + 43,41 Nilai IC
50
: 50
= 0,304x + 43,41 0,304x
= 50 – 43,41 0,304x
= 6,59 x
= 21,67 IC
50
= 21,67 mgL = 21,67 ppm
Universitas Sumatera Utara
68
68
Lampiran 8. Hasil Perhitungan Kadar Air dan Kadar Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem.
Kadar air serbuk daun tumbuhan loning diperoleh dari perhitungan sebagai berikut :
Berat sampel = 2 gram
Berat setelah pemanasan = 1,810 gram
Kehilangan bobot = 2 gram – 1,810 gram
= 0,19 gram
Kadar ekstrak metanol diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut : Berat sampel kering
= 200 gram Berat ekstrak
= 20,75 gram
Universitas Sumatera Utara
69
69
Lampiran 9. Pembuatan larutan DPPH 0,3 mM
Universitas Sumatera Utara
54
54
DAFTAR PUSTAKA
Agoes, G. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung : Penerbit ITB Press. Apak, R. 2007. Comparative Evaluation of Various Total Antioxidant Capacity
Assay Applied to Phenolic Compounds with The CUPPRAC Assay .
Molecules 12:1496-1547
Ajizah, A. 2004 . Sensitivitas Salmonella Tyhimurium Terhadap Ekstrak Daun Psidium Guajava L. Jurnal Bioscientiae. Volume 1. Nomor 1. Halaman 36.
Andlauer,W. and Furst,P. 2001.Food Research International. Germany : Institute For Biological Chemistry And Nutrition, University of Honenheim
Artini, P.E.U.D., Astuti,K.W. dan Warditiani, N.K. 2013. Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Rimpang Bangle Zingiber purpureum Roxb.. volume 2.Nomor
4. Jimbaran-Bali: Universitas Udayana Astarina, N.W.G., Astuti, K.W. dan Warditiani, N.K. 2013. Skrining Fitokimia
Ekstrak Rimpang Bangle Zingiber purpureum Roxb.. Volume 2.Nomor 4. Jimbaran-Bali : Universitas Udayana
Bintang, M. 2010. Biokimia-Teknik Penelitian. Jakarta : Erlangga Buckle, K.A. 2007. Ilmu Pangan. Penerjemah Hari Purnomo dan Adiono.
Jakarta:Universitas Indonesia. Candra,R.A. 2012. Isolasi dan Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Alkaloid dari
Ekstrak Daun Phoebe declinata Nees. [Skripsi]. Depok: Universitas Indonesia, Program Sarjana
Clinical and Laboratory Standars Institue, 2007. Performance Standars for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing; Seventeenth Informational
Supplement . M100-S17, Vol.27, No.3
Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi. Padang : Andalas University Press
Dalimartha, S. 2006. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jilid 4. Puspaswara. Jakarta.
Depkes RI. 2000 . Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat . Cetakan Pertama. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat Makanan.
Universitas Sumatera Utara
55
55
Erawati. 2002. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Garciniadaedalanthera Pierre Dengan Metode DPPH 1,1-Difenil Pikrilhidrazil dan
Identifikasi Golongan Senyawa Kimia dari Fraksi Paling Aktif , Skripsi
Sarjana Farmasi Universitas Indonesia. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Umum.
Gaman,P.M. 1992. Ilmu Pangan. Edisi Kedua. Yogyakarta : Gajah Mada University Press.
Harborne, J.B. 2003. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Edisi II
. Institut Teknologi Bandung. Bandung Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan . Penerjamah : Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Edisi
Ketiga. Bandung : ITB Press. Irianto,K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung: Yrama
Widya. Jawetz., Melnick. dan Adelberg’s. 1995. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20,
Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jayakumari, S.,Ravichandiran,V and Rao, N. 2014. Antimocrobial Activity of
Pisonia grandis R.Br. Leaf Extract and Its Fraction. Vol 3. India :
Department of Pharmacognosy, School of Pharmaceuticl Sciences, VELS University Pallavaram.
Kosasih, E. N. 2004. Peran Antioksidan Pada Lanjut Usia. Jakarta : Pusat Kajian Nasional Majalah Lanjut Usia.
Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung : ITB. Molyneux, P. 2004. The Use of Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl
DPPH for Estimating Antioxidant Activity, Journal Science of Technology
. Pokornya, J.N. Yanishlieva and N.Gordon. 2001. Antioxidant in Food. Woodhead
Publishing Limited : England. Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Yogyakarta: Penerbit Erlangga
Purwantoro, R.S., Siregar, H.M., Sudarmono. dan Praptiwi. 2010. Uji Antibakteri Lasianthus
Rubiceae Sebagai Tumbuhan Berkhasiat Obat Dan Upaya Perbanyakannya. Bogor : Buletin Kebun Raya volume 13, No. 2.
Rahayu, P. Winiati. 2000. Aktivitas Antimikroba Bumbu Masakan Tradisional Hasil Olahan Industri Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak
. Vol 112. Buletin Teknologi dan Industri Pangan.
Universitas Sumatera Utara
56
56
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB. Setyowati, W.A.E., Sri Retno, D.A., Ashadi., Bakti, M., Cici Putri, R. 2014.
Skrining Fitokimia dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Metanol Kulit Durian Durio zibethinus Murr. Varietas Petruk. Surakarta:
Universitas Sebelas Maret
Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia dalam Farmasi. Bandung : Penerbit ITB Subeki. 1998. Pengaruh Cara Pemasakan Terhadap Kandungan Antioksidan
Beberapa macam Sayuran Serta Daya Serap dan Retensinya pada Tikus Percobaan
. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Syukur, C. 2001. Budidaya Tanaman Obat Komersial. Jakarta : Penebar Swadaya
Tortora, G.J. 2001. Microbiology an Introduction. Edisi Ketujuh. New York : M Addison Wesley Longman, Inc. Halaman 86-88.
Viljanen, K. 2005. Protein Oxidation and Protein-Lipid Interactions in Different Food Models in the Presence of Berry Phenolics.
[Dissertation]. Finland : University of Helsinki, Department of Applied Chemistry and
Microbiology Widodo, W. 2005. Tanaman Beracun dalam Kehidupan Ternak. Malang :
Penerbit Universitas Muhammadiah Malang Press Widyastuti, N. 2010. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode
CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman
, Skripsi Sarjana Sains Institut Pertanian Bogor.
Universitas Sumatera Utara
27
27
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu:
Nama Alat Merek
1. Autoklaf Fiesher Scientific
2. Rotary evaporator Buchi
3. Spektrofotometer UV-VIS SP-300
4. Incubator fiber scientific
5. Neraca Analitik Sartorius
6. Oven fischer scientific
7. Pipet Volume Pyrex
8. Bunsen -
9. Pipet mikro -
10. Blender -
11. Bola Karet -
12. Cawan petri -
13. Corong -
14. Penangas Air -
15. Statif dan Klem -
16. Gelas Erlenmeyer Pyrex
17. Gelas Beaker Pyrex
18. Desikator -
19. Gelas Ukur Pyrex
20. Tabung reaksi -
21. Batang pengaduk -
22. Jangka sorong -
23. Vortex -
Universitas Sumatera Utara
28
28
3.2 Bahan-Bahan
Sedangkan bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini yaitu:
Bahan Merek
1. Daun tumbuhan Loning -
2. Metanol -
3. Etil asetat -
4. Etanol p.a. Merck
5. Aquadest
-
6. FeCl
3
5
-
7. CeSO
4
dalam H
2
SO
4
10 -
8. Pereaksi Wagner -
9. Pereaksi Maeyer -
10. Pereaksi Bouchardat -
11. Pereaksi Dragendorf
-
12. DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazil p.a. Aldrich
13. DMSO dimetilsulfoksida p.a. Fisons
14. Mueller Hinton Agar MHA -
15. Nutrient Broth NB Merck
16. Nutrient Agar NA Merck
17. Bakteri Staphylococcus aureus -
18. Bakteri Escherichia coli
-
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daun tumbuhan loning yang
diperoleh dari Desa Lau Baleng, Kabupaten Karo. Daun tumbuhan loning dipisahkan dari batangnya dan dikeringkan dalam ruangan sampai kering
kemudian dihaluskan dengan blender kemudian ditentukan kadar airnya.
Universitas Sumatera Utara
29
29
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Metanol dari Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst. Seem.
Daun tumbuhan loning dipisahkan dari batangnya, lalu dikeringkan dalam ruangan sampai kering, setelah kering diblender. Kemudian diekstraksi dengan
menggunakan pelarut metanol, selama 2x24 jam, dilakukan beberapa kali
pengulangan hingga larutan berwarna jernih. Kemudian dirotarievaporator dan filtratnya yang dihasilkan diuapkan diatas penangas air sampai dihasilkan ekstrak
kering. Ekstrak kering yang dihasilkan diuji skrining fitokimia, aktivitas antioksidan dengan menggunakan DPPH 2,2-diphenyl-1-pycril-hydrazil dan
antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan menggunakan metode difusi agar.
3.3.3 Uji Skrining Fitokimia
1. Alkaloida
Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam 4 tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Wagner, jika terbentuk endapan jingga,
maka positif mengandung alkaloida. Tabung II ditetesi pereaksi Maeyer, jika terbentuk endapan putih, maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi
pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan cokelat, maka positif mengandung alkaloida dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf, jika terbentuk endapan
jingga, maka positif mengandung alkaloida.
2. Flavonoida
Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam 2 tabung reaksi. Tabung I ditetesi NaOH 10, jika terbentuk larutan warna biru
violet maka positif mengandung flavonoida. Tabung II ditambah serbuk Mg dan HCl pekat, jika terbentuk larutan warna jingga maka positif mengandung
flavonoida.
3. Tanin
Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan FeCl
3
5. Jika terbentuk larutan warna biru kehitaman maka positif mengandung tanin.
Universitas Sumatera Utara
30
30
4. Terpenoida
Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan CeSO
4
1 dalam H
2
SO
4
10. Jika terbentuk endapan warna merah kecokelatan maka positif mengandung terpenoida.
5. Saponin
Ekstrak metanol daun tumbuhan loning masing-masing ditambah 10 ml aquades, kemudian dikocok kuat-kuat. Jika muncul busa yang stabil maka positif
mengandung saponin.
3.3.4 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl- hydrazil
3.3.4.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mM
Larutan DPPH 0,3 mM dibuat dengan melarutkan 11,85 mg serbuk DPPH dalam etanol p.a dalam labu takar 100 mL, kemudian dihomogenkan.
3.3.4.2 Pembuatan Variasi konsentrasi
Ekstrak metanol dibuat larutan induk 1000 ppm, dengan melarutkan 0,025 g ekstrak metanol dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian dari
larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm. Kemudian dari larutan 100 ppm dibuat lagi variasi konsentrasi 20, 40, 60, dan 80 ppm.
3.2.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan a. Larutan Blanko
Sebanyak 1 ml larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan 2,5 ml etanol p.a. Dihomogenkan dalam tabung reaksi dan dibiarkan selama 30 menit pada ruang
gelap. Setelah itu diukur absorbansi dengan panjang gelombang maksimum 515 nm.
b. Uji Aktivitas Antioksidan Sampel
Sebanyak 1 ml larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan 2,5 ml ekstrak metanol dengan konsentrasi 20 ppm, dihomogenkan dalam tabung reaksi dan dibiarkan
selama 30 menit pada ruang gelap.
Universitas Sumatera Utara
31
31
Setelah itu diukur absorbansi dengan panjang gelombang maksimum 515 nm.
3.3.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol
3.3.5.1 Pembuatan Media Nutrien Agar NA Miring Dan Sub Kultur Bakteri
Dimasukkan 7 g media NA ke dalam gelas erlenmeyer, dilarutkan dengan 250 ml aquadest yang diikuti dengan pemanasan dan pengadukan, lalu disterilkan di
dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Kemudian dituangkan
kedalam empat tabung reaksi sebanyak 3 ml dibiarkan memadat pada posisi miring membentuk sudut 30
-45 C. Diambil biakan bakteri Staphylococcus
aureus dan Eschericia coli dari strain utama dengan jarum ose lalu digoreskan
pada media NA yang telah memadat. Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35
C.
3.3.5.2 Pembuatan Media Muller Hinton Agar MHA
Dimasukkan 19 g media MHA ke dalam gelas erlenmeyer, dilarutkan dengan 500 ml aquadest yang diikuti dengan pemanasan dan pengadukan, lalu disterilkan di
dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.
3.2.5.3 Pembuatan Media Nutrient Broth NB
Sebanyak 3,25 g media NB dilarutkan dengan 250 ml aquades dalam erlemenyer dan dipanaskan hingga semua larut, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu
121 C selama 15 menit.
3.3.5.4 Pembuatan Inokulum Bakteri
Dimasukkan 10 ml media nutrient broth NB steril dalam tabung reaksi diambil koloni bakteri Staphylococcus aureus dari stok kultur bakteri dengan jarum ose,
disuspensikan kedalam nutrien broth dan diinkubasikan selama 2-3 jam pada suhu 35
o
C, kemudian dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar Mcfarland. Dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Eschericia coli.
Universitas Sumatera Utara
32
32
3.3.5.5 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol
Dimasukkan 0,1 ml inokulum bakteri Staphylococcus aureus kedalam cawan petri kemudian ditambahkan 15 ml media MHA dengan suhu 45
-50 C dihomogenkan
sampai media dan bakteri tercampur rata dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan masing-masing sampel
yang telah berisi bakteri dan diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam dalam
inkubator. Setelah itu diukur zona bening yang ada disekitar kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong. Dilakukan perlakuan yang sama untuk inokulum
dari bakteri Eschericia coli untuk konsentrasi 100,200,300,400,500 mgml.
3.3.5.6 Pembuatan Variasi Konsentrasi
Dibuat larutan dengan konsentrasi 500 mgml dengan cara melarutkan 500 mg ekstrak metanol dalam 1 ml DMSO didalam botol vial, kemudian diencerkan
menjadi 400 mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 500 mgml sebanyak 0,8 ml ditambah dengan 0,2 ml DMSO,kemudian diencerkan menjadi
300 mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 400 mgml sebanyak 0,75 ml ditambah dengan 0,25 ml DMSO,kemudian diencerkan menjadi 200
mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 300 mgml sebanyak 0,67 ml ditambah dengan 0,33 ml DMSO,kemudian diencerkan kembali menjadi 100
mgml dengan cara memipet larutan dengan konsentrasi 200 mgml sebanyak 0,5 ml ditambah dengan 0,5 ml DMSO.
Universitas Sumatera Utara
33
33
Ekstrak Metanol Daun Loning
dimasukkan kedalam tabung reaksi
tabung I + pereaksi Wagner
tabung II + pereaksi Maeyer
tabung III + pereaksi
Dragendorf
tabungIV + pereaksi
Bouchardat tabung I +
NaOH 10
tabung II + logam Mg +
HCl p ditambahkan
FeCl
3
5 ditambahkan
CeSO
4
1 dalam
H
2
SO
4
10 ditambahkan
aquadest
dikocok kuat-kuat
Alkaloida Flavonoida
Tanin Terpenoida
Saponin
3.4 Bagan Penelitian 3.4.1 Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia
umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem.
Universitas Sumatera Utara
34
34
serbuk daun tumbuhan loning
ditimbang sebanyak 200 g
serbuk daun tumbuhan loning sebanyak 200 g
dimaserasi dengan 2 liter metanol selama 2x24 jam
disaring dirotarievaporator hingga dihasilkan
filtrat dipekatkan diatas penangas air
ekstrak metanol daun tumbuhan loning
3.4.2 Ekstraksi Serbuk Daun Tumbuhan Loning dengan Pelarut Metanol
Universitas Sumatera Utara
35
35
0,025 g Ekstrak Metanol Daun Loning dimasukkan kedalam labu takar 25 ml
ditambahkan etanol p.a sampai garis batas dihomogenkan
25 ml larutan 1000 ppm dipipet sebanyak 5 ml
dimasukkan kedalam labu takar 50 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis batas
dihomogenkan 50 ml larutan 100 ppm
dibuat variasi 20, 40, 60, 80 ppm
25 ml larutan 20 ppm 25 ml larutan 40 ppm 25 ml larutan 60 ppm
25 ml larutan 80 ppm dipipet 5 ml dengan
pipet volume dimasukkan ke
dalam labu takar 25 ml
ditambahkan etanol p.a hingga
garis batas
dihomogenkan dipipet 10 ml dengan
pipet volume dimasukkan ke
dalam labu takar 25 ml
ditambahkan etanol p.a hingga
garis batas
dihomogenkan dipipet 15 ml dengan
pipet volume dimasukkan ke
dalam labu takar 25 ml
ditambahkan etanol p.a hingga
garis batas
dihomogenkan dihomogenkan
ditambahkan etanol p.a hingga
garis batas dimasukkan ke
dalam labu takar 25 ml
dipipet 20 ml dengan pipet volume
3.4.3
Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning Pisonia umbellifera J.R. Forst G. Forst Seem.
1. Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Loning