3.8 Cara Kerja Menurut Pratama, 2005 3.8.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Terlebih dahulu alat dan bahan yang akan digunakan seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, penjepit, media agar NA, media Nutrien Broth, dan
seluruh alat dan bahan kecuali ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum
, distrelisasi di dalam autoclave selama 120 menit dengan mengatur tekanan sebesar 15 dynecm3 1 atm dan suhu sebesar 121ºC pada
termometer .
17
3.8.2. Persiapan sampel
Rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum di beli dari Pasar ciputat, yang homogen sebanyak 2 kg kemudian dibersihkan dan dirajang halus.
17
3.8.3. Pembuatan ekstrak lengkuas merah
Metode yang digunakan dalam mengekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum, yaitu dengan menggunakan metode maserasi.
Didalam metode maserasi menggunakan pelarut etanol. Sebanyak 1,5 kg rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum terlebih dahulu dibersihkan dan
kemudian diangin-anginkan lalu dirajang halus. Selanjutnya direndam dalam 3 liter pelarut etanol selama 3 x 24 jam lalu disaring. Maserasi dilakukan dengan
pengadukan sebanyak 12x selama 15 menit dengan tenggang waktu 5 menit antar pengadukan, selanjutnya dilakukan penyaringan dengan corong dan kertas saring
what-man 42 untuk memisahkan filtrat dari ampas.
17
Hasil saringan kemudian diuapkan pelarutnya dengan menggunakan rotary evaporator
, sehingga didapatkan ekstrak kental yang bebas dari pelarut. Ekstrak yang dihasilkan digunakan untuk pengujian selanjutnya. Ekstrak rimpang
lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum akan digunakan dan dibuat konsentrasi : 1ml ekstrak murni, 1ml ekstrak + 1ml pelarut etanol dan konsentrasi
1ml ekstrak + 2ml pelarut etanol.
3.8.4. Pembuatan media
Sebanyak 20 GramNA Nutrient Agar ditimbang dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml lalu ditambahkan dengan aquades sampai menjadi 1
liter, serta dipanaskan sambil diaduk sampai semua bahan larut dengan sempurna, kemudian disterilkan dalam autoclaf selama 120 menit dengan suhu 121ºC.
Ditimbang sebanyak 6,5 Grammedia NB Nutrien Broth ditambahkan dengan aquades sampai menjadi 50 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga
semua bahan larut, setelah itu media disterilkan pada autoclaf dengan suhu 121ºC selama 15 menit.
17
3.8.5. Regenerasi Bakteri
Bakteri Escherichia coli dan Bakteri Staphylococcus aureus yang akan diujikan, terlebih dahulu harus diregenerasikan. Hal pertama yang dilakukan yaitu
membuat media miring NA yang baru. Media NA dituangkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diletakkan dalam posisi miring dan didiamkan hingga agar
memadat. Selanjutnya menggoreskan biakan dari stok Bakteri ke agar miring NA. Lalu diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam. Dari biakan
tersebut diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam 5 ml media NB sebagai suspensi Bakteri Escherichia coli. Selanjutnya diinkubasi di dalam inkubator
bergoyang shaker selama 3 x 24 jam dengan kecepatan 150 rpm.
17
3.8.6 Uji awal penentuan inhibitor concentration
