Desain Penelitian Waktu dan Tempat Bahan yang diuji Sampel Penelitian Alur Penelitian Analisis data

16

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian ekperimental laboratorik melalui metode disc diffusion untuk melihat pengaruh ekstrak lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum dengan menggunakan pelarut etanol dalam menghambat pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus dan Bakteri Escherichia coli.

3.2 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan 23 Januari 2012 hingga 15 Juli 2012 di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Proses ekstraksi lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat BALITRO Bogor.

3.3 Bahan yang diuji

Ekstrak rimpang lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum yang telah diekstraksi oleh Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat BALITRO Bogor dengan metode maserasi menggunakan cairan pelarut etanol 96.

3.4 Sampel Penelitian

Bakteri Staphylococcus aureus dan Bakteri Escherichia coli yang dibiakkan dalam agar Mac Conkey MCA dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. 3.5 Identifikasi Variabel 3.5.1 Variabel Bebas Ekstrak rimpang lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum menggunakan konsentrasi 1 ml ekstrak murni, 1 ml ekstrak + 1 ml pelarut, 1 ml ekstrak + 2 pelarut.

3.5.2 Variabel Terikat

Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus dan Bakteri Escherichia coli yang dibiakkan dalam agar Mac Conkey MCA dan diinkubasi pada suhu 37°C.selama 24 jam 3.6 Alat dan Bahan 3.6.1 Alat-alat yang digunakan pada penelitian Dalam penelitian ini, alat-alat yang digunakan meliputi : - Autoklaf, Tabung Reaksi, Ose, Spatula, Cawan petri, Cakram disc blank, Vortex, Penggaris, Laminar air flow, Blender, Inkubator, Gelas kimia, Swab kapas, Lampu spritus, Pinset.

3.6.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: - Perbenihan agar nutrien, biakan S.aureus pada MSA, biakan E.coli pada agar endomc.conkey, Lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum , Aquadest, NaCl, Cakram Antibiotik, Alcohol 70, Etanol 96.

3.7 Alur Penelitian

Pengumpulan lengkuas merah Sterilisasi alat dan bahan Ekstraksi lengkuas merah Pembuatan stok dan Bakteri variable konsentrasi Tahap pengujian pertumbuhan Bakteri Penetapan potensi Determinasi 3.8 Cara Kerja Menurut Pratama, 2005 3.8.1 Sterilisasi Alat dan Bahan Terlebih dahulu alat dan bahan yang akan digunakan seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, penjepit, media agar NA, media Nutrien Broth, dan seluruh alat dan bahan kecuali ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum , distrelisasi di dalam autoclave selama 120 menit dengan mengatur tekanan sebesar 15 dynecm3 1 atm dan suhu sebesar 121ºC pada termometer . 17

3.8.2. Persiapan sampel

Rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum di beli dari Pasar ciputat, yang homogen sebanyak 2 kg kemudian dibersihkan dan dirajang halus. 17

3.8.3. Pembuatan ekstrak lengkuas merah

Metode yang digunakan dalam mengekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum, yaitu dengan menggunakan metode maserasi. Didalam metode maserasi menggunakan pelarut etanol. Sebanyak 1,5 kg rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum terlebih dahulu dibersihkan dan kemudian diangin-anginkan lalu dirajang halus. Selanjutnya direndam dalam 3 liter pelarut etanol selama 3 x 24 jam lalu disaring. Maserasi dilakukan dengan pengadukan sebanyak 12x selama 15 menit dengan tenggang waktu 5 menit antar pengadukan, selanjutnya dilakukan penyaringan dengan corong dan kertas saring what-man 42 untuk memisahkan filtrat dari ampas. 17 Hasil saringan kemudian diuapkan pelarutnya dengan menggunakan rotary evaporator , sehingga didapatkan ekstrak kental yang bebas dari pelarut. Ekstrak yang dihasilkan digunakan untuk pengujian selanjutnya. Ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum akan digunakan dan dibuat konsentrasi : 1ml ekstrak murni, 1ml ekstrak + 1ml pelarut etanol dan konsentrasi 1ml ekstrak + 2ml pelarut etanol.

3.8.4. Pembuatan media

Sebanyak 20 GramNA Nutrient Agar ditimbang dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml lalu ditambahkan dengan aquades sampai menjadi 1 liter, serta dipanaskan sambil diaduk sampai semua bahan larut dengan sempurna, kemudian disterilkan dalam autoclaf selama 120 menit dengan suhu 121ºC. Ditimbang sebanyak 6,5 Grammedia NB Nutrien Broth ditambahkan dengan aquades sampai menjadi 50 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga semua bahan larut, setelah itu media disterilkan pada autoclaf dengan suhu 121ºC selama 15 menit. 17

3.8.5. Regenerasi Bakteri

Bakteri Escherichia coli dan Bakteri Staphylococcus aureus yang akan diujikan, terlebih dahulu harus diregenerasikan. Hal pertama yang dilakukan yaitu membuat media miring NA yang baru. Media NA dituangkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diletakkan dalam posisi miring dan didiamkan hingga agar memadat. Selanjutnya menggoreskan biakan dari stok Bakteri ke agar miring NA. Lalu diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam. Dari biakan tersebut diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam 5 ml media NB sebagai suspensi Bakteri Escherichia coli. Selanjutnya diinkubasi di dalam inkubator bergoyang shaker selama 3 x 24 jam dengan kecepatan 150 rpm. 17

3.8.6 Uji awal penentuan inhibitor concentration

3.8.6.1 Pembuatan stok variabel konsentrasi

Stok konsentrasi yang divariasikan untuk uji awal pada ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum dengan menggunakan pelarut etanol yaitu dimulai dari konsentrasi ekstrak murni, 1ml ekstrak + 1ml pelarut etanol, 1ml ekstrak + 2ml pelarut etanol yang kesemuanya berjumlah 3 variabel. Pembuatan konsentrasi tersebut dengan cara melakukan pengenceran. Pengenceran dilakukan dengan cara sebagai berikut untuk pembuatan konsentrasi ekstrak murni, diambil 1 ml ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum yang diekstrak dengan etanol, untuk konsentrasi 1 ml ekstrak + 1 ml pelarut etanol, diambil 1 ml ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum yang diekstrak dengan etanol dan kemudian ditambahkan 1 ml pelarut etanol . untuk konsentrasi 1 ml ekstrak + 2 ml pelarut etanol, diambil 1 ml ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum yang diekstrak dengan etanol dan kemudian ditambahkan 2 ml pelarut etanol. Maka berat ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum dengan pelarut etanol sebagai ekstraktan yang akan ambil berturut-turut yaitu 1 ml. Selanjutnya diamati pada konsetrasi mana terjadi penghambatan pertumbuhan Bakteri Escherichia coli dan Bakteri Staphylococcus aureus. 17

3.8.7 Uji Efektivitas

Media NA sebanyak 10 ml dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat ,kemudian dimasukkan 1 ml suspensi Bakteri Escherichia coli dan Bakteri Staphylococcus aureus kemudian disebarkan biakan kedua Bakteri dengan menggunakan lidi kapas steril agar suspensi tersebar merata pada media dan didiamkan selama 10 menit agar suspensi terserap pada media. Kemudian cawan petri tersebut diletakkan 1 buah kertas cakram berdiameter 6 mm dengan menggunakan pinset steril yang telah direndam. Kertas cakram tersebut sebelumnya telah dicelupkan ke dalam setiap konsentrasi ekstrak rimpang lengkuas merah Alpinia purpurata K.Schum yang telah diekstrak dengan etanol. Selanjutnya semua media diinkubasi ke dalam inkubator. Inkubasi dilakukan pada suhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian diukur diameter zona bening yang terbentuk dengan menggunakan penggaris milimeter. 17 Aktivitas anti Bakteri diperoleh dengan mengukur zona bening pada media yang padat yang menjadi petunjuk ada atau tidaknya Bakteri yang tumbuh pada setiap perlakuan. 17

3.9 Analisis data

Analisis data pada penelitian ini menggunakan uji hipotesis komparatif numerik lebih dari 2 kelompok tidak berpasangan sehingga uji statitik yang digunakan adalah One way Anova jika distribusi normal. Jika distribusi data tidak normal maka menggunakan uji nonparametrik yakni Uji Kruskall-Wallis. Untuk menentukan konsentrasi mana yang memiliki kebermaknaan maka dilakukan analisi Post Hoc menggunakan uji Mann-Whitney. Dan juga uji uji Mann- Whitney untuk membedakan kebermaknaan antara kedua Bakteri. 21

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Zona Hambat Ekstrak lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum terhadap Bakteri Staphylococcus aureus S.aureus Uji efektivitas ekstrak lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum terhadap pertumbuhan bakteri S. Aureus yang di uji mengunakan metode difusi agar dengan 3 macam konsentrasi, yaitu 1 ml ekstrak murni, 1ml ekstrak + 1 ml pelarut, 1 ml ekstrak + 2 ml pelarut. Hasil uji efektivitas ekstrak lengkuas merah terhadap bakteri S. Aureus didapat sebagai berikut : Gambar 4.1 Daya hambat ekstrak lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum terhadap pertumbuhan Bakteri S.aureus Dari diagram diatas menunjukkan hasil pada kelompok perlakuan dengan ekstrak lengkuas merah konsentrasi 1 ml ekstrak murni didapat rata-rata zona hambat S.Aureus sebesar 15 mm. Konsentrasi tersebut memberikan daya hambat terbesar dari efektivitas ekstrak lengkuas merah. Pada konsentrasi 1 : 1 didapat rata-rata zona hambat 11,3 mm; pada konsentrasi 1 : 2 didapat rata-rata zona hambat 7,3 mm; pada kontrol positif didapat rata-rata 45,6 mm; dan sedangkan pada kontrol negatif tidak menunjukkan zona hambat. 10 20 30 40 50 1:00 1:01 1:02 kontrol + kontrol - z o n a h a m b a t m m konsentrasi esktrak lengkuas merah Alpina purpurata K.Schum zona hambat