Tabel 4 Ringkasan percobaan dari setiap tahap penelitian
Penelitian Faktor-faktor
Pengamatan atau Analisis 1.
Penapisan BAL berdasarkan sintas selama rekonstitusi susu formula pada suhu 50
o
C
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk digunakan
pada penelitian Penggunaan suhu
rekonstitusi Total bakteri BAL yang
masih bertahan sebelum dan sesudah rekonstitusi
2. Kompetisi isolat BAL asal ASI dengan C. sakazakii YRC3a dalam susu formula
rekonstitusi
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk
dikompetisikan dengan C. sakazakii YRC3a
Perubahan nilai pH dan jumlah total BAL
setelah kompetisi Total bakteri C. sakazakii
YRC3a setelah kompetisi
3. Sintas BAL selama proses pengeringan beku freeze-drying
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk digunakan
pada uji kompetisi tahap 4 Proses pembekuan
dan pengeringan beku Total bakteri BAL yang
masih bertahan sebelum dan sesudah proses pengeringan
beku
4. Kompetisi BAL dan C. sakazakii YRC3a pada susu formula dengan berbagai
suhu rekonstitusi
• Melakukan uji kompetisi BAL dan C. sakazakii
YRC3a pada suhu rekonstitusi 50, 60, dan
70 °C
• Penghitungan jumlah BAL dan C. sakazakii YRC3a
yang ditumbuhkan pada media selektif selama
hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam
• Pengukuran pH dan suhu selama hang time 0, 2, 4,
6, dan 8 jam • Penggunaan suhu
rekonstitusi yang semakin meningkat
• Lamanya hang time
• Lamanya hang time
• Penurunan log BAL dan C. sakazakii YRC3a
sebelum dan setelah rekonstitusi
• Melihat pertumbuhan BAL dan C. sakazakii YRC3a
selama hang time
• Perubahan nilai pH dan suhu pasca rekonstitusi dan
selama hang time
b. Prosedur Kerja
1 Penapisan bakteri asam laktat berdasarkan sintas selama rekonstitusi
susu formula pada suhu 50
o
C Modifikasi Meutia 2009; Fitriyah 2011
Rekonstitusi dilakukan pada suhu 50 °C untuk mendapatkan isolat BAL asal ASI yang paling tahan terhadap suhu rekonstitusi 50 °C, untuk diikutsertakan
pada tahap kedua. Penapisan dilakukan terhadap 11 jenis isolat BAL asal ASI
yang memiliki kemampuan menghambat E. coli entero patogenik K.1.1 ≥ 1 siklus
log Hartanti 2010. Isolat bakteri asam laktat ditumbuhkan pada media MRSB 10 mL masing-masing sebanyak 6 tabung reaksi, kemudian diinkubasi sampai
akhir fase log yaitu selama 24 jam pada inkubator suhu 37 °C. Dari dua tabung MRSB yang telah ditumbuhi sel BAL diambil 1 mL dan dilakukan pengenceran
dengan media pengencer KH
2
PO
4
9 mL. Serial pengenceran dilakukan untuk menghitung jumlah BAL setelah 24 jam inkubasi. Biomassa sel pada 4 tabung
MRSB tersisa kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit sehingga didapat biomassa sel basah. Selanjutnya biomassa sel basah
tersebut dicuci dengan Buffer Posphate Saline BPS. Pelet sel dari 4 tabung masing-masing disuspensikan ke dalam 10 mL larutan buffer steril. Selanjutnya
masing-masing sebanyak 0,2 mL suspensi BAL biomassa sel basah diinokulasikan pada 2,88 gram susu bubuk formula. Rekonstitusi dilakukan
dengan air steril suhu 27 °C sebagai kontrol dan 50 °C hingga volumenya 20 mL di dalam erlenmeyer 50 mL. Jumlah BAL dalam susu bubuk formula rekonstitusi
diperkirakan sekitar 10
7
CFUmL. Jumlah BAL awal kontrol dan jumlah BAL akhir rekonstitusi suhu 50 °C ditentukan melalui penghitungan dengan metode
tuang pada media MRSA. Selisih log10 antara jumlah koloni awal dan jumlah koloni akhir merupakan besar penurunan jumlah bakteri.
2 Kompetisi isolat BAL asal ASI dengan C. sakazakii YRC3a dalam susu
formula rekonstitusi Modifikasi Meutia 2008; Fitriyah 2011
Isolat BAL ditumbuhkan pada media MRSB 10 mL sebanyak 4 tabung reaksi, kemudian diinkubasi sampai akhir fase log yaitu selama 24 jam pada
inkubator pada suhu 37 °C. Dari dua tabung MRSB yang telah ditumbuhi sel BAL diambil 1 mL dan dilakukan pengenceran dengan media pengencer
KH
2
PO
4
9 mL. Serial pengenceran dilakukan untuk menghitung jumlah BAL setelah 24 jam inkubasi. Biomassa sel pada 2 tabung MRSB
tersisa kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit sehingga didapat biomassa sel basah. Selanjutnya biomassa sel basah tersebut
dicuci dengan buffer posphate saline BPS. Pelet sel dari 2 tabung masing- masing disuspensikan ke dalam 10 mL larutan buffer steril. Pengenceran dengan
media pengencer bufer posfat 9 mL dilakukan sehingga diperoleh jumlah BAL
sekitar 10
8
CFUmL. Hal yang sama juga dilakukan pada C. sakazakii YRC3a, bakteri ini ditumbuhkan pada media TSB 10 mL, selanjutnya diinkubasi
sampai akhir fase log yaitu selama 18 jam pada inkubator suhu 37
o
C. Pengenceran dengan media pengencer bufer posfat 9 mL dilakukan sehingga
diperoleh hasil penghitungan C. sakazakii YRC3a setelah 18 jam inkubasi. Selanjutnya terhadap bakteri C. sakazakii YRC3a dilakukan kembali pengenceran
dengan media pengencer bufer posfat sehingga diperoleh jumlah bakteri sekitar 10
4
CFUmL supaya jumlah C. sakazakii YRC3a pada susu formula rekonstitusi sebesar 10
3
CFUmL. Masing-masing sebanyak 2 mL suspensi BAL jumlah 10
8
CFUmL dan 2 mL suspensi C. sakazakii YRC3a jumlah 10
4
CFUmL diinokulasikan ke dalam 2,88 gram sampel susu formula pada set yang sama. Takaran susu formula
disesuaikan dengan prosedur penyajian yang tertera pada kemasan. Selanjutnya susu formula yang telah mengandung BAL dan C. sakazakii YRC3a
direkonstitusi dengan menggunakan air minum dalam kemasan yang telah disterilkan dengan menggunakan suhu 27
o
C sebagai kontrol dan 50
o
C hingga volumenya 20 mL di dalam erlenmeyer 50 mL. Jumlah masing-masing bakteri
pada susu bubuk formula rekonstitusi diperkirakan 10
8
CFUmL untuk BAL dan 10
3
CFUmL untuk C. sakazakii YRC3a. Penghitungan jumlah bakteri BAL dan C. sakazakii YRC3a dilakukan
dengan metode tuang pada masing-masing media selektif. BAL pada media MRSA-AA media selektif yang mengandung asam asetat glasial dan
C. sakazakii YRC3a pada media TSAYE-SC media selektif yang mengandung yeast extract dan sodium klorida. Penghitungan jumlah masing-masing bakteri
dilakukan pada jam ke-0 dan setelah kompetisi jam ke-24, sehingga diperoleh
data jenis BAL yang paling efektif untuk berkompetisi dan menghambat patogen target.
3 Sintas BAL selama proses pengeringan beku freeze-drying
Puspawati et al. 2010
Sebelum proses pengeringan beku dilakukan produksi biomassa sel BAL. Biomassa BAL dibuat dengan menggunakan media MRSB. Pada medium yang
telah steril diinokulasi kultur BAL yang telah disegarkan sebanyak 10 kemudian
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Kultur kerja selanjutnya dipanen dan sentrifugasi pada kecepatan 1000 rotary per minute rpm selama 10 menit.
Supernatan dipisahkan sehingga diperoleh biomassa basah. Berikut di bawah ini Gambar 4 proses pembuatan biomassa basah dan proses pengeringan BAL
Gambar 5. Proses pengeringan beku terhadap isolat terpilih dilakukan dengan penambahan bahan pelindung kriogenik laktosa dengan konsentrasi 10 bv
dengan perbandingan biomassa basah dengan kriogenik adalah 1:10 biomassa ditambah dengan 10 mL larutan laktosa steril. Isolat yang telah ditambahkan
bahan pelindung dalam bentuk larutan disimpan selama 1 jam pada suhu 23 ºC dengan tujuan untuk memungkinkan terjadinya difusi bahan pelindung ke dalam
sel, selanjutnya dibekukan pada suhu -20 ºC selama 12 jam dan kemudian dikeringkan dengan alat freeze drier merk Labconco pada kondisi -50 ºC;
0,01 Mpa selama 2 hari.
Gambar 4 Proses pembuatan biomassa basah
Gambar 5 Proses pembuatan biomassa kering
Medium MRS Broth Sterilisasi T=121 ºC, t=15 menit
Inokulasi isolat BAL sebanyak 10 Inkubasi T= 37 ºC t=16-20 jam
Sentrifugasi 1000 rpm, t= 10 menit Biomassa Basah
Biomassa Basah Penambahan larutan Laktosa 10 bv 1:10
Pembekuan T= -20 ºC t=12 jam Pengeringan beku
T= -50 ºC; P= 0,01 Mpa; t= 24 jam Biomassa Kering
Uji viabilitas
Viabilitas BAL dianalisis dengan melakukan penghitungan jumlah total BAL sebelum pembekuan sel
+
kriogenik, setelah pembekuan, dan setelah pengeringan beku. Sebelum proses pengeringan beku dilakukan penghitungan
jumlah BAL untuk mengetahui jumlah bakteri awal sebelum penyalutan dengan kriogenik.
4 Kompetisi BAL dan Cronobacter sakazakii YRC3a pada susu formula
dengan berbagai suhu rekonstitusi Modifikasi Fitriyah 2011
Isolat BAL dan C. sakazakii isolat YRC3 terpilih, selanjutnya diikutsertakan pada uji kompetisi pada berbagai suhu rekonstitusi 50, 60, dan 70
o
C, sedangkan isolat BAL dan C. sakazakii isolat YRC3 tunggal sebagai perlakuan kontrol.
Untuk BAL kultur kering beku sebanyak 1 g disuspensikan kedalam 9 mL larutan buffer fosfat. Masing masing sebanyak 0,2 mL isolat BAL dari suspensi yang
berisi 10
10
CFUmL dan 0,2 mL C. sakazakii YRC3 yang berisi 10
5
CFUmL terpilih diinokulasikan pada 2,88 gram susu formula. Jumlah bakteri asam laktat
dan C. sakazakii YRC3a pada sampel susu formula rekonstitusi masing-masing sekitar 10
8
dan 10
3
CFUmL. Susu bubuk formula direkonstitusi dengan air steril sampai volumenya 20 mL di dalam erlenmeyer 50 mL. Rekonstitusi dilakukan
pada suhu 50, 60, dan 70
o
C. Selanjutnya susu formula rekonstitusi dijaga kondisinya pada suhu ruang sampai jam ke-8 hang time. Penghitungan jumlah
total bakteri setelah rekonstitusi dilakukan setiap susu formula rekonstitusi mencapai hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Penghitungan jumlah total masing-
masing bakteri dilakukan pada masing-masing media selektif BAL pada media selektif MRSA-AA dan C. sakazakii YRC3a pada media selektif
TSAYE-SC. Kegiatan pengitungan jumlah masing-masing bakteri dikerjakan 2 kali pengulangan.
Jumlah awal BAL dan C. sakazakii YRC3a sebelum rekonstitusi ditentukan melalui penghitungan jumlah total masing-masing bakteri. BAL kering beku
masing-masing sebanyak 1 g disuspensikan pada 9 mL larutan buffer posfat. Selanjutnya terhadap suspensi BAL yang yang telah mengandung 10
10
CFUmL dilakukan pengenceran pada media buffer posfat sehingga diperoleh jumlah awal
BAL sekitar 10
8
CFUmL. Jumlah awal C. sakazakii YRC3a sebelum rekonstitusi ditentukan dengan mensuspensikan sebanyak 1 mL C. sakazakii YRC3a yang
telah diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 °C. Selanjutnya terhadap C. sakazakii YRC3a dilakukan pengenceran pada media pengencer buffer posfat
sehingga diperoleh jumlah awal sekitar 10
3
CFUmL. Penghitungan jumlah awal BAL dan C. sakazakii YRC3a sebelum rekonstitusi dilakukan dengan metode
tuang pada masing-masing media pertumbuhan yaitu MRSA dan TSA.
5. Metode Analisis
a Derajat Keasaaman pH AOAC 1994
Sampel susu formula rekonstitusi kontrol dan kompetisi sebanyak 20 mL, dihomogenkan dan dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya diukur nilai pHnya
dengan pH meter yang telah dikalibrasi dengan buffer pH 4,0 dan pH 7,0. Perubahan nilai pH diukur setiap susu formula rekontitusi mencapai masa hang
time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Nilai pH diukur sebanyak 2 kali ulangan dari jam ke-0 hingga jam ke-8 selama hang time.
b Perubahan Suhu
Sampel susu formula rekonstitusi kontrol dan kompetisi sebanyak 20 mL. Selanjutnya diukur perubahan suhu sampel susu formula rekonstitusi dengan
termometer. Perubahan suhu diukur setiap susu formula rekontitusi mencapai masa hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Kegiatan ini dilakukan sebanyak 2 kali
ulangan.
c Penghitungan Koloni BAM 2001
Jumlah koloni bakteri BAL dan C. sakazakii YRC3a dihitung setelah diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 48 jam. Koloni bakteri dapat dihitung dengan rumus Standard Plate Count sebagai berikut:
N = ΣC {[1n
1
+ 0,1n
2
+ ...]d} Dimana :
N = jumlah koloni per mL atau per gram produk
∑C = jumlah semua koloni yang dihitung dari 2 cawan
n
1
= jumlah cawan pada pengenceran pertama n
2
= jumlah cawan pada pengenceran kedua d
= pengenceran pertama yang dihitung Limit deteksi metode plating berkisar 25 hingga 250 koloni. Ketika dalam
cawan terdapat koloni kurang dari 25, maka dalam pelaporannya dikatakan bahwa
jumlahnya 2,5x10
1
CFUmL. Jika tidak ditemukan koloni dalam cawan hingga pengenceran terendah, maka pelaporannya sebanyak 1,0x10
1
CFUmL. Namun, jika koloninya melebihi 250, maka dianggap sebagai TBUD tidak bisa untuk
dihitung. Dengan demikian, hanya cawan yang jumlah koloninya berkisar 25 hingga 250 saja yang dapat dihitung sebagai jumlah koloni bakteri yang
diinokulasikan.
6 Analisis Data Steel Torrie 1980; Uyanto 2009
Analisis statistika yang digunakan pada penelitian ini meliputi analisis deskriptif dan analisis kuantitatif.
a Analisis deskriptif digunakan untuk mendeskripsikan hasil Pengujian sintas
BAL terhadap proses pengeringan beku freeze-drying, Kompetisi BAL dan Cronobacter sakazakii isolat YRC3a pada Berbagai Suhu Rekonstitusi
50, 60, dan 70 °C, perubahan nilai pH, dan suhu dianalisis dengan statistika deskriptif.
b Rancangan Acak Lengkap RAL Steel Torrie 1980; Uyanto 2009
Data hasil penapisan bakteri asam laktat berdasarkan sintas selama rekonstitusi suhu 50
o
C dan kompetisi isolat BAL asal ASI dengan Cronobacter sakazakii isolat YRC3a, dianalisis dengan menggunakan
softwear SPSS 16.0 dengan menggunakan model perancangan Rancangan Acak Lengkap RAL satu faktor Anova Single Factor Steel Torrie
1980, dengan uji lanjut berganda Duncan Duncan Multiple Range TestDMRT Uyanto 2009. Model rancangan yang digunakan adalah
sebagai berikut:
Y
ij
= µ + τ
i
+ ε
ij
Keterangan : Yij = Nilai pengamatan pada perlakuan ke-i dengan ulangan ke-j
µ = Rataan umum populasi
τi = Pengaruh perlakuan ke-i, pada ulangan ke-j
εij = Galat percobaan pada perlakuan ke-i, dengan ulangan ke-j
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
