3. METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai Nopember 2011. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium General Microbiology, Fermentation
Microbiology, dan Kimia South East Asia for Food and Agricultural Science and Technology SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari, bahan utama meliputi isolat BAL isolat lokal asal ASI koleksi SEAFAST Center IPB,
merupakan isolat BAL yang memiliki kemampuan menghambat E. coli entero patogenik K.1.1 EPEC K.1.1 Hartanti 2010 yaitu; Lactobacillus rhamnosus
A22, A23, A24, A27, A29, R14, R21, R23, R25, R27, R32, dan B16, serta memiliki ketahanan terhadap suhu tinggi. Isolat Cronobacter sakazakii YRC3a
asal susu formula Meutia 2009. Bahan uji yang digunakan adalah susu formula Sufor bayi dengan
komposisi nutrisi; karbohidrat 62 g100g protein 9,8 g100g; lemak 22,5 g100g, dan nutrisi lainnya informasi komposisi diperoleh dari tabel pada
kemasan produk, akuades steril, air minum dalam kemasan steril. Media yang digunakan yaitu de Mann Rogosa Sharpe Agar MRSA Oxoid CM0361,
de Mann Rogosa Sharpe Broth MRSB Oxoid CM0359, yeast extract, Laktosa Oxoid, Buffer 4 dan 7, buffer kalium dihidro posfat KH
2
PO
4
, Druggan- Forsythe-Iversen DFI Agar Oxoid, CM1055, Brain Heart Infusion BHI
Oxoid CM0225, Buffered Peptone Saline BPS Oxoid CM0509, Tryptose Soy Agar TSA Oxoid CM0131, Tryptose Soy Broth TSB Oxoid CM0129,
TSAYE-SC yeast extract- sodium chloride, dan MRSA-AA acetic acid. Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Freeze drier Labconco
Freezone
6
, pipet mikro Finnpipette berikut tip, vorteks Vortex-Genie 2, Sentrifuse Sorvall, inkubator Incucell MMM-Group, termometer, Oven
Gallenhamp, Hot plate Steroglass, pH Meter Eutech pH meter 700, Autoklaf ALP Model-40, dan alat analisis mikrobiologis standar lainnya.
3.3 Metode Penelitian
a Tahapan penelitian
Tahap pelaksanaan penelitian dan ringkasan percobaan dapat dilihat dalam matriks di bawah ini Gambar 3.
TAHAP 1
TAHAP 2
TAHAP 3
TAHAP 4
Gambar 3 Diagram alir proses penelitian
Rekonstitusi suhu 50 °C
4 isolat BAL paling tahan suhu rekonstitusi T=50 °C
11 isolat BAL asal ASI menghambat EPEC K1.11siklus log Hartanti 2010
Analisis: Total BAL sebelum dan sesudah
rekonstitusi
4 isolat BAL paling tahan suhu rekonstitusi T=50 °C
Uji Kompetisi BAL C.sakazakii YRC3a pada susu formula
Analisis: Total BAL sebelum dan sesudah
kompetisi 24 jam; analisis pH
2 isolat BAL yang mampu berkompetisi dan menghambat C.sakazakii YRC3a
BAL kering beku Isolat terpilih tahap 2
Produksi biomassa sel basah + kriogenik laktosa 10 bv
Pembekuan Biomassa sel T= -22 °C
Analisis: Total BAL sebelum
dan sesudah pembekuan dan sesudah pengeringan beku
Pengeringan beku kultur BAL T= -50 °C; P= 0,01 Mpa; t= 48 jam
BAL kering beku
Uji kompetisi BAL dan C.sakazakii YRC3a pada suhu rekonstitusi 50, 60 70 ºC selama hang time 0, 2, 4, 6 dan 8 jam pada susu formula;
a
BAL;
b
C.sakazakii YRC3a; dan
c
BAL C.sakazakii YRC3a Analisis:
Total BAL, C.sakazakii
YRC3a, pH, dan suhu
C.sakazakii YRC3a
Penelitian ini terdiri dari 4 tahap. Tahap pertama bertujuan untuk menapis isolat BAL asal ASI yang memiliki ketahanan terhadap suhu rekonstitusi 50 ºC.
Rekonstitusi dilakukan pada isolat BAL asal ASI yang telah disentrifugasi biomassa sel bakteri. Pada tahap ini dilakukan analisis total BAL sebelum dan
sesudah rekonstitusi. Selanjutnya dipilih 4 isolat BAL yang paling tahan suhu rekonstitusi. Tahap kedua yaitu kompetisi isolat BAL asal ASI dengan
C. sakazakii YRC3a dalam susu formula rekonstitusi. Tahap ini bertujuan untuk menapis isolat BAL asal ASI yang memiliki kemampuan untuk berkompetisi dan
menghambat pertumbuhan C. sakazakii YRC3a pada susu formula rekonstitusi. Pada tahap ini dilakukan penghitungan jumlah bakteri pada masing-masing media
selektif; BAL media MRSA-AA dan C. sakazakii YRC3a pada media TSAYE- SC pada jam ke-0 dan setelah kompetisi jam ke-24. Analisis pH pada tahap ini
juga dilakukan namun pada set yang terpisah. Tahap ketiga mempelajari sintas BAL selama proses pengeringan beku
freeze-drying. Tujuan tahap ini adalah untuk melihat sintas isolat BAL yang paling tahan terhadap proses pengeringan beku freeze drying. Pengeringan beku
dilakukan pada dua isolat terpilih tahap 2. Pada tahap ini dilakukan analisis viabilitas BAL sebelum pembekuan, setelah pembekuan dan setelah pengeringan
beku. Penelitian tahap keempat adalah kompetisi BAL dan C. sakazakii YRC3a
pada susu formula dengan berbagai suhu rekonstitusi yaitu 50, 60, dan 70 °C. Tahap keempat bertujuan untuk melihat kompetisi isolat BAL asal ASI yang
telah dikering bekukan dengan C. sakazakii YRC3a selama hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Pada tahap ini dilakukan penghitungan jumlah BAL dan C. sakazakii
YRC3a yang diinokulasikan pada susu formula. Penghitungan jumlah masing- masing bakteri dilakukan menggunakan media selektif BAL yaitu media MRSA-
Acetic acid dan C. sakazakii YRC3a pada media TSAYE-Sodium cloride perbandingan BAL dengan C. sakazakii YRC3a 10
8
: 10
3
. Analisis pH dan suhu dilakukan pada set terpisah.
Tahapan-tahapan penelitian, hasil yang diharapkan dan ringkasan penelitian, disajikan pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3 Tahap penelitian, tujuan, dan hasil yang diharapkan
Tahap Penelitian Tujuan
Hasil yang Diharapkan 1.
Penapisan BAL berdasarkan sintas selama rekonstitusi susu formula pada suhu 50
o
C
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk
digunakan pada penelitian Mengetahui jenis isolat
BAL yang tahan terhadap suhu
rekonstitusi 50 °C Isolat BAL yang tahan suhu
rekonstitusi 50 °C
2. Kompetisi isolat BAL asal ASI dengan C. sakazakii YRC3a dalam susu formula
Kategori