BAB III BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan September sampai Oktober 2009. Pengambilan sampel susu dilakukan di beberapa daerah di wilayah Jawa Barat
yaitu Kabupaten Tasikmalaya, Kabupaten Sumedang, Kabupaten Bandung, Kabupaten Bogor, dan Kabupaten Cianjur. Pengujian sampel dilakukan di Balai
Pengujian Mutu Produk Peternakan BPMPP, jalan Pemuda no. 29A Kotamadya Bogor, Jawa Barat.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, tabung sentrifus, labu ukur, gelas ukur, erlenmeyer, botol timbang, pipet
volumetric, pipet graduasi, botol media, pengocok tabung, sentrifus, penangas air, lemari steril, homogenizer, autoklaf, lemari pendingin, freezer, timbangan
analitik, inkubator, magnet pengaduk, pH meter, pipet mikro, jangka sorong, burner,
ose, pinset, dan gunting. Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah susu segar, media agar yeast ekstract, peptone, bacto agar, dextrose, beef
extract, glucose , media cair heart infusion broth, larutan buffer KH
2
PO
4
, Na
2
HPO
4
, H
3
PO
4
, NaOH, K
2
HPO
4
, HCl, NaCl, mikroorganisme spora Bacillus stearothermophilus
ATCC 7953, spora Bacillus cereus ATCC 11778, spora Bacillus subtillis ATCC 6633, vegetatif Kocuria rizophila ATCC 9341,
larutan baku pembanding natrium penisilin, oksitetrasiklin hidroklorida, kanamisin sulfat, tilosin-tartrat, dan kertas cakram.
3.3 Metode Penelitian
Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode uji tapis screening test residu antibiotika pada susu secara bioassay yang
mengacu pada SNI No. 7424:2008.
3.3.1 Pengambilan dan Persiapan Sampel
Sampel yang diuji adalah susu segar berupa sampel kandang yang diperoleh dari beberapa peternakan sapi perah di wilayah Jawa Barat
Kabupaten Tasikmalaya, Kabupaten Sumedang, Kabupaten Bandung,
Kabupaten Bogor, dan Kabupaten Cianjur. Lima sampel diambil dari masing- masing kabupaten kemudian dibawa ke laboratorium dalam cooling box.
3.3.2 Persiapan Uji dan Pengujian Sampel
Pemeriksaan residu antibiotika dalam susu dilakukan dengan metode uji tapis secara bioassay yang ditujukan terhadap empat golongan antibiotika, yaitu
tetrasiklin, makrolida, aminoglikosida, dan penisilin. Secara umum, tahapan pengujian residu antibiotika dalam susu dengan metode ini yaitu sampel susu
yang telah dihomogenisasi diteteskan pada kertas cakram lalu kertas cakram tersebut ditempelkan di atas permukaan media agar yang telah dicampur dengan
biakan bakteri uji dan diinkubasikan pada suhu tertentu tergantung jenis antibiotika yang akan diuji selama 16-18 jam. Contoh susu dinyatakan positif
mengandung residu antibiotika bila terbentuk zona hambatan di sekitar kertas cakram.
3.3.2.4 Persiapan Uji 3.3.2.1.1 Analisa Residu Golongan Penisilin
Persiapan Media Agar
Sebanyak 5 gram peptone, 12 gram yeast extract, 15-18 gram bacto agar, dan 1 gram dextrose dilarutkan dalam 1000 ml aquadest pH 5.7 ± 0.1, didihkan,
dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121
o
C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Persiapan Kultur Media
Bakteri Bacillus stearothermophillus ATCC 7953 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 55
o
C selama 1 minggu. Bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis
steril 20 ml sebanyak 4 tabung. Larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65
o
C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang. Kemudian, ditambahkan
larutan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam refrigerator dengan suhu 4
o
C selama 18-24 jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65
o
C selama 30 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan
diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai suspensi spora.
3.3.2.1.2 Analisa Residu Golongan Aminoglikosida Persiapan Media Agar
Sebanyak 5 gram peptone, 3 gram beef extract, 18 gram bacto agar, dilarutkan dalam 1000 ml aquadest pH 8.5 ± 0.1, didihkan, dan disterilisasi
dengan otoklaf pada suhu 121
o
C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Persiapan Kultur Media
Bakteri Bacillus subtillis ATCC 6633 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 36
o
C selama 1 minggu. Bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis
steril 20 ml sebanyak 4 tabung. Larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65
o
C selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan
larutan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam refrigerator dengan suhu 4-8
o
C selama 18-24 jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65
o
C selama 30 menit. Kemudian, disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan
diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
3.3.2.1.3 Analisa Residu Golongan Tetrasiklin Persiapan Media Agar
Sebanyak 6 gram peptone, 1.5 gram beef extract, 3 gram yeast extract, 15-18 gram bacto agar, dan 1.35 gram KH
2
PO
4
dilarutkan dalam 1000 ml aquadest pH 5.7 ± 0.1, didihkan, dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu
121
o
C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Persiapan Kultur Media
Bakteri Bacillus cereus ATCC 11778 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 30
o
C selama 1 minggu. Kemudian bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis
steril 20 ml sebanyak 4 tabung. Larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65
o
C selama 30 menit, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan
3000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan larutan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan
ke dalam refrigerator dengan suhu 4-8
o
C selama 18-24 jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65
o
C selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil
supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
3.3.2.1.4 Analisa Residu Golongan Makrolida Persiapan Media Agar
Sebanyak 6 gram peptone, 1.5 gram beef extract, 3 gram yeast extract, 1 gram glucose, dan 15-18 gram bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquadest
pH 8.5 ± 0.1, didihkan, dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121
o
C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Persiapan Kultur Media
Bakteri Kocuria rizophillia ATCC 9341 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 18-24 jam. Sebanyak 1 ose kuman biakan
Kocuria rizophillia ATCC 9341 diambil, kemudian dimasukkan ke dalam 10 ml
media Heart Infusion Broth HIB. Kemudian diinkubasikan selama 18-24 jam dalam inkubator dengan suhu 36
o
C. Kuman siap digunakan untuk pengujian.
3.3.2.5 Persiapan Larutan Dapar
Sebanyak 6 gram KH
2
PO
4
dan 18.9 gram Na
2
HPO
4
dilarutkan dalam 1000 ml aquadest lalu larutan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121
o
C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
3.3.2.6 Persiapan Larutan Baku Penisilin
Pengenceran larutan baku dibuat dengan larutan dapar hingga konsentrasi 0,01 IUml.
Larutan baku konsentrasi 1000 IUml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 IUml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 10 IUml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 1 IUml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 0,1 IUml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 0.01 IUml sebagai larutan standar
Tetrasiklin Oksitetrasiklin, Aminoglikosida Kanamisin, dan Makrolida Tilosin
Pengenceran larutan baku dibuat dengan larutan dapar hingga konsentrasi 1.0
gml. Larutan baku konsentrasi 1000
gml. Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 gml.
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 10
gml. Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 1.0 gml sebagai larutan standar
3.3.2.4 Cara Pengujian Sampel Susu
Kultur media disiapkan untuk masing-masing golongan antibiotika. Tiap cawan petri berisi lima lembar kertas cakram, yang terdiri dari tiga kertas cakram
masing-masing ditetesi 75 µl sampel yang akan dianalisa, satu kertas yang ditetesi 75 µl dari larutan baku pembanding sebagai kontrol positif, dan satu
kertas yang ditetesi larutan dapar fosfat sebagai kontrol negatif Gambar 1. Kertas cakram tersebut diletakkan di atas permukaan kultur media. Cawan petri
ditutup dan diinkubasi pada suhu yang berbeda tergantung golongan antibiotika. Kultur media untuk golongan tetrasiklin diinkubasi pada suhu 30
o
C ± 1, golongan penisilin pada suhu 55
o
C ± 1, sedangkan golongan makrolida dan aminoglikosida pada suhu 36
o
C ± 1, masing-masing selama 16-18 jam. Untuk
mendapatkan data yang akurat maka pengujian sampel dilakukan dengan tiga kali pengulangan sehingga setiap jenis golongan antibiotika menggunakan tiga
cawan petri. Hasil uji ditentukan dengan mengamati dan mengukur diameter zona
hambatan yang terbentuk di sekeliling kertas cakram menggunakan jangka sorong. Apabila di sekitar kertas cakram terdapat zona hambatan maka susu
yang diperiksa dinyatakan positif mengandung antibiotika, namun apabila di sekitar kertas cakram tidak terdapat zona hambatan maka susu yang diperiksa
dinyatakan negatif mengandung residu antibiotika. Konsentrasi antibiotika yang berada dalam sampel dapat ditentukan secara semi kuantitatif. Semakin luas
zona hambatan di sekitar kertas indikator maka semakin tinggi konsentrasi residu antibiotika dalam sampel. Berikut adalah salah satu gambar hasil pengujian
residu antibiotika pada sampel Gambar 1.
Gambar 1 Contoh hasil uji residu antibiotika menggunakan metode bioassay. Sampel 1 1, sampel 2 2, sampel 3 3, kontrol positif 4, dan
kontrol negatif 5 2
5
3
4 1
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori