3.6.7 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 2 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-
2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Senduduk
Pembuatan ekstrak daun senduduk dilakukan dengan cara perkolasi menggunakan pelarut etanol 70.
Cara kerja: sebanyak 300 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituang cairan penyari etanol 70 sampai semua simplisia terendam
sempurna dan dibiarkan selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, dituang cairan penyari
secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator dan biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan
menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia.
Perkolasi dihentikan hingga beberapa tetes perkolat yang keluar terakhir diuapkan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary
evaporator dan dikering bekukan dengan freeze dryer Ditjen POM, 1979.
3.8 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat gelas disterilkan didalam oven pada suhu
170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan lampu bunsen Lay, 1994.
3.9 Pembuatan Media
3.9.1 Pembuatan media nutrient agar NA
Komposisi: Lab-Lemco powder 1,0 g
Yeast exstract 2,0 g
Peptone 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Cara pembuatan: Sebanyak 28 g nutrient agar dilarutkan dalam air suling steril ad 1000 ml
kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer. Media nutrient agar disterilkan di
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 2013.
3.9.2 Pembuatan media nutrient broth NB
Komposisi: Lab-Lamco powder 1,0
g Yeast extract
2,0 g
Bacto peptone 5,0
g Sodium chloride
5,0 g
Cara pembuatan: Sebanyak 13 g nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril ad 1000 ml
kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer. Media nutrient broth disterilkan di
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 2013.
3.10 Suspensi Standar Mc Farland 0,5
Komposisi: Larutan BaCl
2
Larutan H 1,175 bv 0,5 ml
2
SO
4
Cara pembuatan: 1 vv
99,5 ml
Kedua larutan dicampurkan dalam tabung reaksi steril, dikocok sampai homogen dan ditutup. Apabila kekeruhan hasil suspensi bakteri sama dengan
kekeruhan suspensi standar berarti konsentrasi bakteri 10
8
3.11 Pembuatan Media Agar Miring
CFUml Vandepitte, 1991.
10 ml media nutrient agar NA yang telah dimasak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditutup dan di bungkus lalu disterilkan di dalam autoklaf selama 15
menit pada suhu 121°C. Tabung yang berisi media nutrient agar diletakkan pada kemiringan 30-45°C. Diperhatikan bahwa media nutrient agar tidak menyentuh
tutup tabung. Media nutrient agar dibiarkan menjadi dingin dan keras Lay, 1994.
3.12 Pembuatan Stok Kultur Bakteri
Masing- masing sebanyak satu ose dari biakan murni bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis dan Escherichia coli
digoreskan dengan metode sinambung pada permukaan nutrien agar NA miring, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas. Diinkubasi selama 18-24 jam pada
suhu 37° C.
3.13 Penyiapan Inokulum Bakteri
Bakteri hasil inkubasi diambil dengan menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml nutrient broth NB steril, kemudian
diinkubasi selama 1-2 jam hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar Mc Farland konsentrasi 10
8
CFUml. Dilakukan pengenceran dengan mempipet 0,1 ml biakan bakteri 10
8
CFUml, dimasukkan ke dalam tabung steril yang berisi nutrient broth NB steril sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen sampai
didapat suspensi bakteri dengan konsentrasi 10
6
3.14 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Daun Senduduk dengan Berbagai Konsentrasi
Kategori