BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan merupakan metode eksperimental experimental research, yang meliputi pengumpulan bahan tumbuhan,
identifikasi bahan tumbuhan, pembuatan simplisia, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, dan pengujian antibakteri ekstrak etanol
daun senduduk Melastoma malabathricum L.. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Obat Tradisional, Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.1 Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Panasonic, bola karet, desikator, freeze dryer Modulio,
inkubator Memmert, jangka sorong, jarum ose, kamera digital Sony, bunsen, krus porselen, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF 1200L, lemari pendingin
Glacio, mikroskop Olympus, neraca kasar, neraca listrik Mettler Toledo, oven Fisher, penangas air, pinset, pipet mikro Eppendorf, rotary evaporator
Stuart, seperangkat alat penetapan kadar, silinder logam dan tanur Nabertherm.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah ekstrak etanol daun senduduk Melastoma malabathricum L, Nutrient agar NA, Nutrient broth NB, suspensi standar Mc
Farland 0,5 dan air suling. Bakteri yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 dan Escherichia coli
ATCC 8939. Bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa, kecuali
dinyatakan lain: dimetil sulfoksida DMSO, amil alkohol, asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III
klorida, bismut III nitrat, eter, etanol, etil asetat, n-heksana, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium sulfat
anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat dan toluena.
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi bahan tumbuhan dan pembuatan simplisia daun senduduk Melastoma
malabathricum L..
3.3.1 Pengambilan bahan tumbuhan
Pengambilan bahan dilakukan secara purposif yaitu diambil dari satu daerah saja tanpa membandingkan dengan tanaman yang sama di daerah lain.
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun Melastoma malabathricum L. yang diperoleh dari Desa Saitihuta, Kecamatan Dolok Sanggul, Kabupaten Humbang
Hasundutan, Provinsi Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi bahan tumbuhan
Identifikasi bahan tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor Jl. Raya Jakarta – Bogor
km. 46 Cibinong, Indonesia. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 43.
3.3.3 Pembuatan simplisia
Pembuatan simplisia daun senduduk dilakukan dengan cara daun yang masih segar dicuci bersih, ditiriskan, ditimbang berat basahnya dan diperoleh
berat basahnya sebesar 6 kg. Daun dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu ±40°C hingga kering. Ditimbang berat kering simplisia dan diperoleh berat
keringnya sebesar 599,6 g. Sebelum digunakan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat. Bagan kerja pembuatan simplisia dapat dilihat pada Lampiran
6, halaman 49.
3.4 Pembuatan Pereaksi
3.4.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml, pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10
ml air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.2 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.3 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida, dilarutkan
dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan
air suling hingga volume larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.4 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM,1995.
3.4.5 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.7 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling
sebanyak 100 ml Ditjen POM, 1995. 3.4.8 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.9 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.10 Pereaksi Lieberman-Bourchard
Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 95. Kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian
volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Ditjen POM, 1995.
3.4.11 Larutan kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1995.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, warna, bau dan rasa dari daun senduduk segar dan simplisia daun senduduk.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun senduduk segar dan serbuk simplisia daun senduduk
.
Daun senduduk segar diiris tipis secara melintang, hasil irisan daun senduduk diletakkan di atas kaca objek, lalu ditetesi
larutan kloralhidrat, dipanaskan di atas api bunsen, ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca
objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Gambar mikroskopik dapat
dilihat pada Lampiran 5, halaman 47.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluena. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung,
tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja :
Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Toluena dibiarkan mendingin selama 20 menit, dan
dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu
dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Pada saat toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi,
kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Saat semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan
selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Saat air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan
ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen
WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.5.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai
kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
3.5.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998;
Ditjen POM, 1995.
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam
etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang
habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang
sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998;
Ditjen POM, 1995.
3.5.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu
yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.6 Skrining Fitokimia
Skirining fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa steroidatriterpenoida, alkaloida, flavonoida, glikosida, glikosida antrakinon,
saponin, tanin.
3.6.1 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan eter 20 ml selama 2 jam, disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20
tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman- Bourchard, diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Apabila terbentuk
warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah,
merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Harborne, 1987. 3.6.2 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi: 1. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
2. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat 3. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit dua dari tiga percobaan di atas Ditjen POM, 1995.
3.6.3 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g
serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 1 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah kekuningan
atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.6.4 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 2 g, lalu disari dengan 20 ml campuran etanol 95 dengan air 7:2 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks
selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:2, dilakukan berulang kali sebanyak 2 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada
temperatur tidak lebih dari 50
o
3.6.5 Pemeriksaan glikosida antrakinon
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan
dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes peraksi Molisch. Secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam
sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan glikosida Ditjen POM, 1995.
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,2 g, kemudian ditambahkan 5 ml asam sulfat pekat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml
benzene, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzene dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzene dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah
dan lapisan benzene tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Ditjen POM, 1995.
3.6.6 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida
2N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995.
3.6.7 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 2 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-
2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Senduduk
Pembuatan ekstrak daun senduduk dilakukan dengan cara perkolasi menggunakan pelarut etanol 70.
Cara kerja: sebanyak 300 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituang cairan penyari etanol 70 sampai semua simplisia terendam
sempurna dan dibiarkan selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, dituang cairan penyari
secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator dan biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan
menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia.
Perkolasi dihentikan hingga beberapa tetes perkolat yang keluar terakhir diuapkan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary
evaporator dan dikering bekukan dengan freeze dryer Ditjen POM, 1979.
3.8 Sterilisasi Alat
Kategori