didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam Cs dan dalam fase gerak Cm.
D = Cm
Cs
Jadi semakin besar nilai D maka migrasi solut semakin lambat; dan semakin kecil nilai D migrasi solut semakin cepat. Solut akan terelusi menurut perbandingan
distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut cukup besar maka campuran-campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan Gandjar dan
Rohman, 2007.
2.3.3 Pemisahan pada kolom
Kolom merupakan bagian terpenting dari keseluruhan peralatan kromatografi karena proses pemisahan campuran komponen. Pada pemisahan
campuran-campuran dalam kolom, solut-solut dicirikan dengan waktu retensi t
R
dan faktor retensi k’ yang berbanding lurus dengan nilai D. t
R
= t
M
1+ k’ Kondisi kromatografi umumnya diatur sedemikian rupa sehingga nilai k’ lebih
kecil daripada 20 untuk menghindari waktu retensi yang terlalu panjang. Nlai k’ dapat dihitung dengan persamaan :
k
’
= t
R
- t
M
t
M
2.3.4 Profil Puncak dan Pelebaran Puncak
Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah
aliran fase gerak. Profil, dikenal juga dengan puncak atau pita, secara perlahan- lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena
solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2. Profil-profil puncak Adanya puncak, yang asimetris dapat disebabkan oleh hal –hal berikut:
Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar maka
fase gerak tidak mampu membawa solut dengan sempurna karenanya terjadi pengekoran atau tailing.
Interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut
sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.
Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu
sehingga menimbulkan puncak mendahului fronting Gandjar dan Rohman, 2007.
2.3.5 Jenis kromatografi
Menurut Johnson dan Stevenson 1991 jenis-jenis kromatografi yaitu: 1.
Kromatografi Cair-Padat LSC Tehnik ini biasanya menggunakan fase diam silika gel atau alumina, meskipun
demikian sekitar 90 kromatografi ini memakai silika gel sebagai fase diamnya. Fase geraknya berupa pelarut non polar yang ditambah dengan pelarut polar
seperti air atau alkohol rantai pendek untuk meningkatkan kemampuan elusinya sehingga tidak timbul pengekoran puncak, seperti n-heksana ditambah metanol.
Jenis KCKT ini sesuai untuk pemisahan-pemisahan campuran isomer struktur dan untuk pemisahan solut dengan gugus fungsional yang berbeda.
2. Kromatografi Partisi LLC
Kromatografi jenis ini disebut juga dengan kromatografi fase terikat. Kebanyakan fase diamnya adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau
Universitas Sumatera Utara
fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non polar seperti oktadesilsilana, oktilsilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilana ODS atau
C
18
dan kebanyakan pemisahannya adalah dengan fase terbalik. Sedangkan fase geraknya adalah campuran asetonitril atau metanol dengan air atau dengan larutan
buffer. Kromatografi partisi LLC, disebut “fase normal” bila fase diam lebih polar
dari fase gerak dan “fase terbalik” bila fase gerak lebih polar dari fase diam. a.
Kromatografi fase normal Kromatografi fase normal fase diam lebih polar daripada fase gerak,
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak ini biasanya tidak polar. Dietil eter, benzen, hidrokarbon lurus seperti
pentana, heksana, heptana maupun iso-oktana sering digunakan. Halida alifatis seperti diklorometana, dikloroetana, butilklorida dan kloroform juga
digunakan. Umumnya gas terlarut tidak menimbulkan masalah pada fase normal. Gandjar dan Rohman, 2007
b. Kromatografi fase terbalik Kromatografi fase terbalik fase diam kurang polar daripada fase gerak,
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Kandungan utama fase gerak fase terbalik adalah air. Pelarut yang dapat
campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dioksan, tetrahidrofuran dan dimetilformamida ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak.
Universitas Sumatera Utara
Dapat ditambahkan pula asam, basa, dapar danatau surfaktan. Mutu air harus tinggi baik air destilasi maupun air mineral.
3. Kromatografi penukar ion
Tehnik ini tergantung pada penukaran adsorpsi ion-ion diantara fase gerak dan tempat-tempat berion dari kemasan. Kebanyakan resin-resin berasal dari
polimer stiren divinilbenzen dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Resin-resin tipe asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin
pilihan paling baik dan banyak digunakan. Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Tehnik ini dipakai secara luas dalam life sciences dan dikenal
secara khas untuk pemisahan asam-asam amino. Tehnik ini dapat dipakai untuk keduanya, kation-kation dan anion-anion.
4. Kromatografi eksklusi EC
Tehnik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari solut. Kemasan adalah suatu gel dengan suatu permukaan berlubang-lubang
sangat kecil yang inert. Molekul-molekul kecil dapat masuk ke dalam jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang. Molekul-molekul yang lebih
besar tidak dapat masuk ke dalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
5. Kromatografi Pasangan Ion IPC
Kromatografi ini merupakan bentuk khusus dari kromatografi cair-cair yang digunakan untuk pemisahan senyawa atau cuplikan yang mengandung
komponen ion dan non ion, seperti garam ammonium kuarterner, sulfonat, asam amino dan aminofenol. Kromatografi pasangan ion dilakukan dengan
Universitas Sumatera Utara
sistem pelarut campuran air dengan metanol atau asetonitril dan kolom seperti oktadesilsilana yang terikat pada silika.
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi