12
berlebihan pada tikus akan menyebabkan kematian dengan gejala-gejala hiper aktif, sawan, kencing terus-menerus dan penurunan berat badan.Yuliarti,2007
2.3. Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman
dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat CaCO
3
. Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk
melakukan analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi merupakan suatu teknik
pemisahan yang mengunakan fase diam stationary phase dan fase gerak mobile phase. Teknik kromatografi telah berkembang dan telah digunakan untuk
memisahkan dan mengkuantifikasikan berbagai macam komponen yang kompleks, baik komponen organik maupun komponen anorganik. Rohman, 2007
2.3.1 Kromatografi Lapis Tipis
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa–senyawa yang dipisahkan terdistribusi sendiri antara fase gerak dan fase
diam dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain.
Faktor–faktor yang memperngaruhi gerakan noda dalam kromatografi yang juga mempengaruhi harga Rf, yaitu :
1. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan.
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya
Universitas Sumatera Utara
13
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap.
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
Meskipun dalam prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut
menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat. 4.
Pelarut dan derajat kemurnian fase gerak Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase pada kromatografi kertas adalah
sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul- betul diperhatikan.
5. Derajat kejenuhan dari uap dalam bejana pengembangan yang
digunakan 6.
Teknik percobaan 7.
Jumlah cuplikan yang digunakan Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan tendensi
penyebrangan noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak seimbang lainnya sehingga mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
8. Suhu
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh
penguapan atau perubahan-perubahan fase. 9.
Kesetimbangan Kesetimbangan dalam kromatografi kertas sangat penting, hingga perlu
mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut
Universitas Sumatera Utara
14
campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat pada bagian tepi–tepi dari pada di bagian tengah.
Sastrohamidjojo. 1985
2.4.Spektrofotometri UV
Spektrofotometri adalah cabang analisis instrumental yang mencakup seluruh metoda pengukuran berdasarkan interaksi antara suatu spektrum sinar Radiasi Elektro
MagnetikREM dengan larutan molekul atau atom. Spektrofotometri uv-vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehinga
spektrofotometri uv-vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibanding kualitatif. Mulja, 1995
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer
dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating ataupun celah
optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi
melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar monokromatis, melainkan suatu
trayek panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai
cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak
Universitas Sumatera Utara
15
yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun
pembanding. Khopkar, 1990. Semua molekul dapat mengabsorpsi radiasi daerah UV-Vis karena mereka
mengandung elektron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi Underwood, 2002.
Hukum Lambert – Beer Hukum Lambert – Beer digunakan untuk radiasi monokromatik, dimana
absorbansi sebanding dengan tebal medium b dan konsentrasi c senyawa yang mengabsorbsi. Hal ini dapat dinyatakan dengan persamaan sebagai berikut :
A = a.b……………………………....2.1 Dimana a adalah faktor kesebandingan yang disebut absorptivitas. Besarnya dan
ukuran daria tergantung pada satuan untuk b dan c. Untuk larutan dari senyawa yang mengabsorpsi, sering diberikan dalam centimeter dan c dalam gram per Liter. Maka
absorptivitas dalam satuan L.g-1.cm-1 Skoog, 1996. Ketika persamaan 2.1 dinyatakan dalam mol per liter dan tebal medium
dalam centimeter, absorptivitas disebut molar absorptivitas dan diberi simbol khusus yaitu
ε. Jadi, ketika badalah centimeter dan c dalam mol per Liter makapersamaannya adalah sebagai berikut :
A = ε.b.c…………………………….2.2
Dimana
ε dalam satuan L.mol-1.cm-1 Skoog, 1996. Keterbatasan Hukum Lambert – Beer
Beberapa pengecualian ditemukan untuk menyamaratakan absorbansi sebagai garis lurus. Di sisi lain, penyimpangan dari perbandingan langsung diantara
absorbansi dan konsentrasi ketika b adalah konstan seringkali ditemukan. Beberapa
Universitas Sumatera Utara
16
penyimpangan ini adalah dasar dan menunjukkan keterbatasan yang nyata dari hukum
ini Skoog, 1996.
Hubungan antara kadar dengan intensitas sinar yang diserap oleh sampel yang di analisis dinyatakan oleh hukum Lambert-Berr dalam bentuk persamaan sebagai
berikut : Log IoI = A=a.b.C
Dimana: Io= intensitas sinar sebelum melewati sampel
I = intensitas sinar setelah melewati sampel A = absorban
a = absopsifitas molekul b = ketebalan kuvet
C = konsentrasi larutan Oleh karena a dan b nilainya tetap wadah yang dipakai spesifik, maka A
berbanding lurus dengan C konsentrasi larutan. Dalam penurunan hukum ini dianggap bahwa, 1 radiasi yang masuk adalah monokromatik, 2 spesies penyerap
berkelakuan tidak tergantung satu terhadap lainnya dalam proses penyerapan, 3 penyerapan terjadi dalam volume yang mempunyai luas penampang yang sama, 4
dengan radiasi tenaga adalah cepat tidak terjadi fluorosensi, dan 5 indeks bias tak tergantung pada konsentrasi tidak berlaku pada konsentrasi yang tinggi.
Sastrohamidjojo.1985 Komponen-komponen pokok dari Spektrofotometer meliputi :
1. Sumber tenaga radiasi yang stabil
2. Sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, cela-cela, dll.
Universitas Sumatera Utara
17
3. Monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang
gelombang tunggal. 4.
Tempat cuplikan yang transparan 5.
Detektor radiasi yang dihubungkan dengan sistem meter atau pencatat. Diagram sederhana dari Spektrofotometer UV-Vis adalah sebagai berikut:
Satrohamidjojo. 1985
Uraian bagan spektrofotometri UV-Vis yaitu sebagai berikut :
1. Sumber radiasi
Sumber-sumber radiasi ultraviolet kebanyakan digunakan adalah lampu hidrogen dan lampu deuterium. Sumber radiasi cahaya tampak yang paling umum
dipakai adalah lampu pijar tungsten. Lampu tungsten merupakan campuran dari filament tungstein dan gas iodine halogen. Sumber radiasi ini dapat memancarkan
radiasi kontinyu antara 380-780 nm. 2.
Monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optic yang menguraikan radiasi
polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang gelombang-gelombang tunggalnya dan memisahkan panjang gelombang-gelombang tersebut menjadi jalur-
jalur yang sangat sempit.
sampel
Meter atau pencatat Detektor
Monokromator Sumber radiasi
Blanko
Universitas Sumatera Utara
18
3. Tempat cuplikan
Culipkan yang dipakai pada daerah ultraviolet atau terlihat yang biasa berupa gas atau larutan ditempatkan dalam sel atau cuvet. Untuk daerah ultraviolet biasanya
digunakan quartz atau sel dari silika yang lebur, sedangkan untuk daerah terlihat digunakan gelas biasa atau quarzt. Sel yang digunakan untuk cuplikan yang berupa
gas mempunyai panjang lintasan dari 0,1 hingga 100 nm, sedangkan sel untuk larutan mempunyai panjang lintasan tertentu dari 1 hingga 10 cm
4. Detektor atau pencatat
Setiap detektor menyerap tenaga foton yang mengenainya dan mengubah tenaga tersebut untuk dapat diukur secara kualitatif seperti sebagai arus listrik atau
perubahan-perubahan panas. Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal listrik yang dapat mengaktifkan meteran atau pencatat, setiap pencatat harus menghasilkan yang
secara kualitatif berkaitan dengan tenaga cahaya yang mengenainya. 5.
Penetapan Kadar Dengan Spektrofotometri Ada empat cara menentukan kadar zat tunggal dengan metode
spektrofotometri: a.
Membandingkan serapan atau transmisi zat yang dianalisis dengan zat murni. Dalam hal ini dilakukan pengukuran serapan zat A
X
serapan zat standar A
S
, pada panjang gelombang yang sama yaitu
λ
maks, sehingga kadar zat X sebagai:
C
X
=
�� ��
[ ��������������������]
Persyaratan diusahakan pembacaan A x dan A s tidak berbeda jauh. b.
Dengan membuat kurva baku.Kurva baku dibuat pada sistem koordinat Carstein dimana sebagai absis adalah konsentrasizat standar, dan sebagai
ordinat adalah serapannya. Pengamatan serapan dilakukan pada
λ
maks.
Universitas Sumatera Utara
19
c. Dengan memakai sostem ekstingsi spesifik �E
1 ��
1
� . cara ini sebagai salah satu
usaha analisis kuantitatif zat tunggal dengan metode spektrofotometri yang dalam
hal ini tidak mempunyai zat standar. Dengan jalan membandingkan
E
1 ��
1
dari zat yang tertera dalam pustaka, maka kadar zat tersebut akan dapat diketahui.
d. Dengan memakai nilai ekstingsi molar
ε
. Cara ini akan memberikan hasil yang lebih tepat dan pada prinsipnya sama dengan cara ketiga. Harga
ε
dapat dinyatakan sebagai: 6.
Kesalahan Pengukuran Secara Spektrofotometri Pengukuran secara spektrofotometri dari konsentrasi zat berwarna didasarkan
pada validitas hukum Lambert-Beer. Dampak praktek, hasil pengukuran memperlihatkan beberapa penyimpangan, diantaranya penyimpangan nyata dan aktual
sebenarnya. Penyimpangan nyata pada prinsipnya berasal dari ketidaksempurnaan. Penyimpangan ini disebabkan oleh ketidakmampuan monokromator untuk
memberikan cahaya yang benar-benar monokromatis sehingga menyebabkan peristiwa seperti transmisi, pemantulan, dan serapan pada medium. Penyimpangan
yang disebabkan oleh ketidaksempurnaannya cahaya monokromatik pada prinsipnya disebabkan oleh absorpsifitas yang berbeda sesuai dengan panjang gelombang dari
sumber cahaya yang diserap atau tergantung dari spektrum serapannya. Sedangkan penyimpanan sebenarnya disebabkan oleh perubahan konsentrasi zat pengabsorpsi
cahaya yang berlangsung akibat tercapainya kesetimbangan kimia dibawah pengaruh gaya interion atau intermolekul. Tetapi, ada kalanya dipengaruhi oleh rasio
konsentrasi komponen berwarna dan tak berwarna dari larutan yang dianalisis. Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan
spektrofotometri uv-vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang
Universitas Sumatera Utara
20
akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel, karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut ini adalah tahap-tahap yang
harus diperhatikan : a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar uv-vis
b .Waktu operasional c. Pemilihan panjang gelombang
d. Pembuatan kurva baku e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan Gandjar, 2007
Beberapa perbedaan yang juga merupakan keunggulan dari spektrofotometer uv-vis dibanding dengan spektrofotometer uv-vis yang lainnya adalah :
1. Memakai sumber radiasi tunggal yaitu lampu D
2
Dauterium 2.
Radiasi yang diukur adalah radiasi polikromatis, sehingga sampelkompartemen benda dalam keadaan terbuka
3. ”Wavelenght reproducibility” karena tidak ada gerakan mekanisme untuk
mengatur panjang gelombang. 4.
Kecepatan scanning, keseluruhan daerah pengukuran panjang gelombang sangat tinggi.
Pada spektrofotometer uv-vis ada beberapa macam sumber radiasi yang dipakai yakni lampu deuterium, lampu tungsten dan lampu merkuri. Setiap bagian
peralatan optik dari spektrofotometer uv-vis memegang fungsi dan peranan tersendiri yang saling terkait fungsi dan peranannya. Setiap fungsi dan peranan tiap bagian
dituntut ketelitian dan ketepatan yang optimal, sehingga akan diperoleh hasil pengukuran yang tinggi tingkat ketelitian dan ketepatannya. Mulja, 1995
Universitas Sumatera Utara
21
Metode-metode yang digunakan dalam menentukan asam benzoat selain metode spektrofotometri yaitu :
1. Kualitatif SNI 1992
a. Uji dengan FeCl
3
- Sampel dalam bentuk laruan diambil sebanyak 50 gramdimasukkan
kedalam labu ukur 250 mldan tambahkan 10 ml NaOH 10 agar bersifat basa dan larutan NaCl jenuh 30 gram dalam 100ml air, ditepatkan tanda
kocok dan dibiarkan selama 2 jam, disaring dengan kertas saring. -
Sebanyak 50 ml filtrat masukkan kedalam corong pisah 250 m dan asamkan dengan HCl 1 : 3 berlebih, ditambahkan 10-15 ml eter lau
kocok. Lapisan eter ditampung dalam labu erlenmeyer 50 ml dan d uapkan. Residu dengan pemanasan ditambah NH
4
OH sampai basa, dab hilangkan kelebihan NH
3
dengan penguapan, kemudian ditambahFeCl
3
5 netral. Apabila terbentuk endapan kecoklatan berarti benzoat positif.
b. Dengan cara destilasi uap
Sampel diekstrak kedalam eter dari larutan asam diuji dengan TLC atau spekrorofotometer UV.
2. Kuantitatif
a. Titrimetri tanpa pemanasan
Sampel dimasukkan kedamal labu ukur, ditambahkan NaCl jenuh secukupnya, buat alkalis kertas lakmus dengan NaCl 10 atau dengan
suspensi CaOH
2
. Encerkan dengan NaCl jenuh, kocok. Biarkan selama 2 jam, kocok berulang dan saring. Jika cotoh mengandung banyak lemak,
Universitas Sumatera Utara
22
ditambah larutan NaOH 10 kedalam saringan. Ekstraksi eter sebelum dilanjutkan cara kerja.
b. Ekstraksi dan titrimetri
c. Metode titrasi, melalui ekstraksi memakai alat perforator khusus untuk
contoh-contoh yang berwarna d.
Kromatografi gas Digunakan untuk sari apel, pasta almond, ikan, makanan yang kaya protein
dan karbohidrat. e.
Metode HPLC Eluen asam asetat- metanol, seperangkat HPLCdengan kolomµ- Bondapak
CN waters dan jenis detektor UV dengan panjang gelombang yang bervariasi.
Pereksi : Asam Bnzoat , metanol pro HPLC, asam sitrat, dan asam asetat glasial. Cahyadi, 2008
Universitas Sumatera Utara
23
Universitas Sumatera Utara
BAB III BAHAN DAN METODE
3.1. Alat dan Bahan