Pelat yang digunakan untuk KLT pada densitometri sebaiknya digunakan pelat buatan pabrik, karena pada pelat buatan sendiri fase diamnya kurang rata,
sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri, yaitu berupa puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang kompaknya
fase diam, puncak yang kasar disebabkan permukaan pelat kurang rata Mintarsih, 1990.
Ada dua cara penetapan dengan alat densitometer. Pertama, setiap kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan dielusi
bersama dalam satu lempeng, kemudian Area Under Curve AUC sampel dibandingkan dengan AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat kurva
hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam konsentrasi
minimal tiga macam konsentrasi. Bercak yang diperoleh dicari AUC dengan densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan : y = bx + a, dimana x adalah
banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC Supardjan, 2002.
H. Validasi Metode Analisis
1. Tinjauan Umum
Validasi metode menurut USP dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang
akan dianalisis. Secara singkat, validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisis yang akan digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan Rohman,
2009.
Kategori yang terdapat dalam United State of Pharmacopeia USP dan International Conference on Harmonization ICH:
a. Kategori I
Metode untuk kuantifikasi komponen mayor dalam produk ruahan aktif, termasuk senyawa-senyawa pengawet dalam produk akhir obat,
diklasifikasikan dalam kategori I. Metode uji dan keseragaman kandungan masuk dalam kategori ini. Analisis ini tidak diisyaratkan pada
uji keseragaman kandungan ini, karenanya penentuan Limit of Detection LOD dan Limit of Quantification LOQ dalam uji ini tidaklah penting
Rohman, 2009. b.
Kategori II Metode
kategori II
ditujukan untuk
menentukan pengotorpengganggu impurities dalam ruahan obat bulk, produk-
produk degradasi dalam produk akhir obat atau dalam proses pembersihan cleanng process. Metode ini lebih lanjut dibagi menjadi 2
yaitu ke dalam uji kuantitatif dan uji batas limit test Rohman, 2009. c.
Kategori III Metode-metode yang digunakan untuk menentukan karakteristik
kinerja produk akhir jatuh pada kategori III. Uji disolusi tidak termasuk pengukurannya dan uji-uji pelepasan obat merupakan contoh metode
yang masuk kategori ini Rohman, 2009.
Tabel I. Elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi
Parameter Pengujian
Pengujian kategori II
Uji kategori
Kinerja kategori I
Kuantitatif Uji
Batas III
Analisis Akurasi
Ya Ya
Presisi Ya
Ya Tidak
Ya Spesifisitas
Ya Ya
Ya LOD
Tidak Tidak
Ya LOQ
Tidak Ya
Tidak Linieritas
Ya Ya
Tidak Kisaran range
Ya Ya
Ruggedness Ya
Ya Ya
Ya mungkin dibutuhkan, tergantung pada uji spesifiknya
2. Parameter Validasi
a. Akurasi
Akurasi atau kecermatan metode analisis adalah kedekatan hasil analisis yang diperoleh dengan menggunakan metode tersebut dengan nilai
yang sebenarnya. Penentuan kecermatan metode analisis biasanya dinyatakan dengan persen perolehan kembali terhadap sampel yang
kadarnya telah diketahui dengan pasti Mulja dan Suharman, 1995. b.
Presisi Presisi suatu metode analisis merupakan sejumlah pencaran hasil
yang diperoleh dari analisis berulang kali pada suatu sampel homogen. Presisi umumnya dinyatakan dalam coefficient of variation CV Mulja
dan Hanwar, 2003.
