16
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini bersifat eksperimental yang terdiri dari beberapa tahapan meliputi: pengumpulan pecut kuda, identifikasi tumbuhan, pembuatan simplisia
pecut kuda, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan crude ekstrak etanol pecut kuda, dan pengujian efek diuretik. Data yang diperoleh di analisis
secara ANAVA analisis variansi dan dilanjutkan dengan uji beda rata-rata Tukey menggunakan program statistical and product service solution SPSS 18.0.
3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, neraca listrik, pH meter, timbangan hewan, rotary evaporator,
mortir dan stamper, oral sonde, seperangkat alat pengujian diuresis berupa modifikasi kandang metabolik, Spektrofotometer Serapan Atom SSA.
3.1.2 Bahan-bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba pecut kuda. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro
analisis yaitu etanol 96, karboksi metil selulosa natrium CMC-Na, saline, aqua bidestilata, baku kalium, baku natrium, dan tablet furosemid.
3.1.3 Pengumpulan Herba Pecut Kuda
Pengumpulan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Tumbuhan yang digunakan dalam penelitian
Universitas Sumatera Utara
17 ini adalah herba pecut kuda yang diambil dari daerah Bukit Simarsayang, Kota
Padang Sidimpuan, Provinsi Sumatera Utara.
3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi Bogor. Hasil
identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 52.
3.3 Pembuatan Simplisia
Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah herba pecut kuda yang masih segar. Tumbuhan dicuci hingga bersih kemudian ditiriskan, dirajang
kasar dan ditimbang, diperoleh berat basah sebesar 2,1 kg. Selanjutnya herba pecut kuda tersebut dikeringkan dalam lemari pengering pada temperatur ± 40º C
sampai kering. Simplisia yang telah kering diblender menjadi serbuk, ditimbang dan diperoleh berat simplisia sebesar 600 g. Lalu dimasukkan ke dalam wadah
botol plastik bertutup rapat dan disimpan pada suhu kamar.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi bouchardat, dragendroff, meyer, Molish, timbal II asetat 0,4 M, Kloralhidrat pereaksi asam klorida 0,2 N, asam klorida 2
N, natrium Hidroksida 2 N, besi III klorida 1 bv Lieberman-Bourchard Ditjen, POM, 1979
Universitas Sumatera Utara
18
3.4.1 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, kemudian sebanyak 2 g iodium dilarutkan dalam larutan kalium
iodida, setelah larut dicukupkan volume dengan air suling hingga 100 mL. 3.4.2 Pereaksi Dragendroff
Sebanyak 8 g bismuth III nitrat dilarutkan dalam 20 mL asam nitrat pekat, pada wadah lain sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 mL air
suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Selanjutnya diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling
hingga 100 mL. 3.4.3 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,3596 g raksa II klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 mL. pada wadah lain ditimbang 5 g kalium iodida lalu
dilarutkan dalam 10 mL air suling, kemudian keduanya dicampur dan
ditambahkan air suling hingga 100 mL. 3.4.4 Pereaksi besi III klorida 1 bv
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dengan air
hingga 100 mL. 3.4.5 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 mL.
3.4.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL.
Universitas Sumatera Utara
19
3.4.7 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 1,7 mL asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 mL.
3.4.8 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL
3.4.9 Pereaksi Lieberman-Bouchardat
Sebanyak 5 mL asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 5 mL asam sulfat pekat, lalu tambahkan 50 mL etanol kedalam campuran tersebut.
3.4.10 Pereaksi Kloralhidrat Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 mL air suling.
3.5 Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air,
penetapan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam Depkes R.I, 1995.
3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik dan Organoleptik
Pemeriksaan makroskopik dan organoleptik dilakukan dengan mengamati
bentuk, rasa, bau, dan warna dari simplisia herba pecut kuda. 3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap simplisia dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan
Universitas Sumatera Utara
20 kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati dibawah
mikroskop.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari alas bulat 500 mL, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima 10 mL. Caranya: a.
penjenuhan toluene Sebanyak 200 mL toluena dan 2 mL air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit,
kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL WHO, 1992.
b. penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu lalu dipanaskan selama 15 menit. Setelah toluen
mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik.
Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
dingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai
dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
21
3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL air-kloroform 2,5 mL kloroform dalam air suling 1000 mL dalam
labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 mL filtrat sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Hitung kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes R.I,
1995.
3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimasersi selama 24 jam dalam 100 mL etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20 mL filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasarkan rata yang
telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara
Depkes R.I, 1995.
3.5.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak lebih kurang 2 g sampai 3 g zat yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam kurs porselen yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Kurs dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu
total dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes R.I, 1995.
Universitas Sumatera Utara
22
3.5.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu didinginkan dengan 25 mL asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring dengan kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu
yang tidak larut asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan diudara Depkes R.I, 1995.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan crude ekstrak etanol pecut kuda meliputi: pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavanoid, glikosida, tanin,
saponin dan steroidtriterpenoid 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk simplisia dan crude ekstrak etanol pecut kuda ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling,
dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu
kedalamnya dimasukkan 0,5 mL filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi:
1. Tabung 1 ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
2. Tabung 2 ditambahkan 2 tetes pereaksi Bauchardat
3. Tabung 3 ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Akaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas Depkes R.I, 1995.
Universitas Sumatera Utara
23
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 g simplisia dan crude ekstrak etanol pecut kuda masing- masing ditambahkan 10 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring
dalam keadaan panas, ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan
dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.6.3 Pemeriksaan Glikosida
Simplisia dan crude ekstrak etanol pecut kuda masing-masing ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 mL campuran etanol 96 dengan air 7:3 dan
10 mL asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 mL filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal II
asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran isopropil dan kloroform 2:3, dilakukan berulang kali sebanyak 3
kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50º C. Sisanya dilarutkan dalam 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara
perlahan-lahan ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan
ikatan gula Depkes, R.I. 1995.
3.6.4 Pemeriksaan Saponin
Simplisia dan crude ekstrak etanol pecut kuda masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 mL
air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 - 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang
Universitas Sumatera Utara
24 dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin
Depkes, R.I. 1995.
3.6.5 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dan crude ekstrak etanol pecut kuda dimaserasi dengan 20 mL eter selama 2 jam, disaring, setelah itu filtrate yang
diperoleh diuapkan dengan menggunakan cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 2 tetes pereaksi Lieberman-Bourchad. Apabila terbentuk warna ungu
atau merah yang berubah menjadi biru atau hijau menunjukkan adanya steroidtriterpenoid yang terkandung di dalam simplisia atau ekstrak Harbone,
1987.
3.6.6 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 mL air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 mL
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.7 Pembuatan Ekstrak Herba Pecut Kuda
Pembuatan crude ekstrak etanol pecut kuda dilakukan secara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96. Caranya, sebanyak 500 g serbuk
simplisia pecut kuda dimasukkan kedalam bejana kaca kemudian dituangi cairan penyari sebanyak 375 mL sampai semua simplisia terendam dan ditutup,
dibiarkan selama 3 hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk kemudian disaring, ampasnya dimaserasi dengan 125 mL etanol 96 disimpan dalam bejana
tertutup di tempat sejuk, terlindung dari cahaya matahari selama 2 hari, kemudian
Universitas Sumatera Utara
25 dienaptuangkan. Maserat yang diperoleh diuapkan dengan menggunaka rotary
evaporator ± 40
o
C kemudian dipekatkan Ditjen POM, 1979.
3.8 Penyiapan Bahan Uji, Obat Pembanding, dan Kontrol