17
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 TAHAP PENDAHULUAN
4.1.1 Pemilihan Bakteri Protelitik Terbaik
Isolat bakteri proteolitik yang digunakan terdiri atas dua isolat yaitu FLp1 dan FLp2. Kedua isolat ini ditumbuhkan dalam media yang mengandung susu skim 1. Penyediaan sumber
karbon dan kondisi fisik diperlukan untuk menghasilkan pertumbuhan yang optimum agar kedua isolat mampu memanfaatkan media skim sebagai media pertumbuhannya.
Penentuan pertumbuhan bakteri berdasarkan pengukuran biomassa secara tidak langsung berdasarkan kerapatan optik optical density. Pengukuran biomassa bertujuan untuk mengetahui
pola pertumbuhan dari isolat yang ada. Banyaknya biomassa di dalam larutan sebanding dengan besarnya absorbansi yang diperoleh dari hasil pengukuran spektrofotometer. Semakin besar
absorbansi larutan yang diperoleh maka jumlah biomassa di dalam larutan semakin banyak. Kurva pertumbuhan dan aktivitas enzim proteolitik dijelaskan pada Gambar 4.
Gambar 4. Kurva pertumbuhan dan aktivitas enzim bakteri proteolitik pada media skim 1 yang diinkubasi pada suhu 30
o
C Pada awal pengukuran terbentuk daerah kurva yang konstan antara absorbansi dengan
pertambahan waktu inkubasi. Daerah ini dikenal sebagai fase adaptasi bakteri terhadap media. Setelah fase adaptasi, bertambahnya waktu inkubasi menyebabkan peningkatan absorbansi yang
cukup besar menyerupai kurva logaritmik. Pada fase ini jumlah biomassa di dalam larutan media meningkat pesat hingga mencapai maksimum. Hal ini disebabkan nutrisi bakteri yang ada pada
media susu skim masih cukup melimpah. Fase ini dikenal dengan fase eksponensial. Fase eksponensial merupakan fase dimana bakteri mengalami pertumbuhan yang optimal atau suatu
periode pertimbuhan bakteri yang cepat. Berdasarkan kurva tumbuh diatas, isolat FLp1 mulai memasuki fase eksponensial pada jam ke-12. Isolat FLp2 mulai memasuki fase eksponensial pada
jam ke-6. Perbedaan pertumbuhan bakteri ini menunjukkan adanya keanekaragaman fisiologis dan respons yang berbeda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya Pelczar dan Chan,
2007. 0,0
0,2 0,4
0,6 0,8
1,0 1,2
1,4 1,6
0,1 0,2
0,3 0,4
0,5 0,6
0,7 0,8
6 12 18 24 30 36 42 48 54 A
k tiv
it as
en zim
u n
it m
l
OD
Waktu jam
Kurva tumbuh FLp1 Kurva tumbuh FLp2
Aktivitas enzim FLp1 Aktivitas enzim FLp2
18
Setelah biomassa maksimum tercapai, bertambahnya waktu inkubasi menyebabkan absorbansi menurun yang mungkin disebabkan banyaknya kematian bakteri di dalam media cair.
Hal ini disebabkan nutrisi yang terdapat di dalam media skim yang sudah mulai berkurang. Fase ini disebut dengan fase kematian. Isolat FLp1 dan FLp2 yang ditumbuhkan pada media susu skim
memiliki waktu optimum yang berbeda dalam memproduksi enzim protease. Perbedaan waktu optimum aktivitas enzim menunjukkan adanya keberagaman fisiologi diantara masing-masing
isolat dalam memanfaatkan susu skim sebagai sumber karbon Pelczar dan Chan, 2007. Isolat FLp1 mencapai aktivitas enzim tertinggi pada jam ke-24 sebesar 1.4 unitml
sedangkan isolat FLp2 memproduksi enzim protease tertinggi pada jam ke-18 sebesar 0.5 unitml. Pada saat aktivitas enzim optimum, maka bakteri mengeluarkan enzim secara maksimal. Bila
dihubungkan dengan fase pertumbuhan mikroba, maka aktivitas enzim tertinggi tersebut terdapat pada fase eksponensial menjelang fase stasioner. Pembentukan enzim protease mulai meningkat
selama masa fase eksponensial kemudian meningkat dengan cepat menjelang fase stasioner. Dalam keadaan normal sintesis enzim ekstraseluler maksimum terjadi sebelum fase stasioner atau
akhir fase eksponensial menjelang fase stasioner. Umumnya setelah fase stasioner, aktivitas enzim akan menurun. Hal ini disebabkan oleh adanya hasil-hasil metabolisme yang dapat
menghambat aktivitas enzim Sumarlin, 2008. Isolat FLp1 memiliki aktivitas enzim lebih tinggi dibandingkan isolat FLp2 yaitu sebesar
1.4 unitml pada waktu inkubasi jam ke-24 sedangkan isolat FLp2 hanya mencapai 0.5 unitml yang diproduksi pada waktu inkubasi jam ke-18. Produksi enzim FLp1 dan FLp2 lebih tinggi
dibandingkan dengan yang dilakukan Sumarlin 2008, isolat proteolitik Bacillus circulans pada media air rendaman kedelai memiliki aktivitas enzim proteolitik tertinggi pada jam ke-56 sebesar
0.1814 unitml. Menurut Sumarlin 2008 rendahnya aktivitas enzim dapat disebabkan kadar garam, pH, dan substrat. Penurunan aktivitas juga berkaitan dengan kegiatan saling
menghidrolisis diantara protease pada saat substrat mulai berkurang karena protease juga merupakan suatu protein
Berdasarkan Gambar 4. Aktivitas enzim mengalami fluktuasi atau terdapat dua puncak. Hal ini disebabkan bakteri mendegradasi protein dalam waktu yang tidak sama, selain itu selama
inkubasi kompleks enzim bekerja pada waktu yang berbeda atau muncul banyak enzim yang dihasilkan, selain itu dapat disebabkan oleh adanya isoenzim yang merupakan protein berbeda
yang dapat mengkatalisis reaksi yang sama yang menghambat kerja aktivitas enzim Madigan dan Martinko, 2006.
Setelah fase eksponensial, aktvitas enzim menurun. Hal ini disebabkan bakteri mengalami fase kematian dimana pada fase tersebut terjadi kompetisi sumber substrat sehingga banyak sel
bakteri yang tidak mendapatkan sumber karbon dan mengalami kematian. Dengan berkurangnya jumlah sel bakteri maka enzim yang dihasilkan ikut menurun.
Aktivitas enzim spesifik yang dihasilkan akan meningkat sesuai dengan peningkatan aktivitas enzimnya. Aktivitas spesifik adalah satu unit enzim per milligram protein. Aktivitas
spesifik diperoleh berdasarkan kadar protein yang terkandung dari media hasil kultivasi. Kadar protein terlarut dan aktivitas spesifik enzim dijelaskan pada Gambar 5.
19
Gambar 5. Kadar protein dan aktivitas spesifik bakteri proteolitik dalam media susu skim 1 pada suhu 30
o
C Nilai aktivitas spesifik bergantung pada kadar protein terlarutnya, kadat protein terlarut
yang terukur pada penelitian tidak hanya protein yang berasal dari degradasi enzim namun juga berasal dari media yang digunakan. Nilai aktivitas spesifik FLp1 lebih tinggi dibandingkan FLp2.
Hal ini serupa dengan nilai aktivitas enzimnya. Nilai aktivitas spesifik tertinggi pada FLp1 yaitu sebesar 10.8 unitmg yang diproduksi pada waktu inkubasi jam ke-24, sedangkan pada FLp2
sebesar 5.4 unitmg yang diproduksi pada waktu inkubasi ke-18. Hasil kurva diatas membuktikan bahwa pada isolat proteolitik FLp1 terdapat enzim protease dengan komposisi paling banyak
dibandingkan isolat FLp2. Isolat yang memiliki nilai aktivitas enzim terbesar dari kedua isolat ini akan digunakan sebagai starter proteolitik dalam hidrolisis kulit kopi melalui fermentasi padat.
Aktivitas enzim meningkat seiring dengan pertumbuhannya, namun pada bakteri FLp1 dan FLp2 mengalami fluktuasi. Pertumbuhan mikroba mengalami dua puncak yaitu pada pada jam
ke-24 dan 42 pada isolat FLp1, jam ke-18 dan 36 pada isolat FLp1. Fluktuasi juga terjadi pada aktivitas enzim dan aktivitas spesifiknya. Hal ini dapat disebabkan bakteri mendegradasi substrat
dalam waktu yang tidak sama. Selain itu, selama inkubasi, kompleks enzim bekerja pada waktu yang berbeda atau muncul jenis enzim protease lain yang dihasilkan Madigan dan Martinko,
2006. Berdasarkan aktivitas enzim dan aktivitas spesifiknya, isolat FLp1 memiliki aktivitas
enzim dan aktivitas spesifik yang lebih tinggi dibandingkan FLp2, oleh karena itu isolat FLp1 yang akan digunakan sebagai inokulum dalam fermentasi padat untuk produksi kopi luwak secara
enzimatis.
4.1.2 Analisis Bahan Baku