Persiapan Substrat dan Inokulum Fermentasi

14

3.3.1.1 Pemilihan bakteri proteolitik

Pemilihan bakteri terbaik berdasarkan aktivitas enzim tertinggi yang dihasilkan bakteri. a. Peremajaan Bakteri Proteolitik Bakteri proteolitik diremajakan pada media Skim Milk Agar SMA. Komposisi media dalam 100 ml terdiri dari susu skim 1 g, Nutrien Broth NB 1,3 g dan Agar-agar 2 g. Susu skim dilarutkan di dalam akuades 30 ml kemudian disterilisasi pada suhu 110 o C selama 5 menit. NB dan agar-agar dilarutkan dalam 70 ml akuades dan disterilisasi pada suhu 121 o C selama 20 menit. Kedua larutan tersebut kemudian di campur secara steril dan di stirrer agar homogen. Media kemudian di tuang kedalam cawan petri sebanyak 20 ml. Media dalam cawan petri yang masih panas diletakkan hingga membeku. Peremajaan dilakukan dengan menggoreskan 1 ose kultur dalam agar miring ke dalam media dalam cawan petri yang telah disiapkan. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam. b. Pertumbuhan bakteri proteolitik dan aktivitas enzim protease Biakan media padat diambil sebanyak 2 cock borer dan dimasukkan ke dalam 100 ml media cair yang mengandung susu skim 1. Selanjutnya biakan diinkubasi dengan shaker incubator pada 100 rpm dan 30 o C. Biakan diukur dengan metode turbidimetri dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm setiap 6 jam selama 48-54 jam. Selain itu untuk mengukur aktivitas enzim, biakan disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang mengandung enzim ekstrak kasar diukur aktivitasnya menggunakan substrat kasein 1 dengan metode Kunitz yang dimodifikasi Walter, 1984. Aktivitas enzim diukur setiap enam jam sekali selama 48-54 jam. Prosedur pengujian aktivitas enzim protease dijelaskan pada Lampiran 4. Unit aktivitas enzim Umg didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 µmol produk tirosin setiap menit pada kondisi pengukuran. d. Pengujian Aktivitas Spesifik Aktivitas spesifik merupakan nilai aktivitas unit enzim dibagi dengan kadar proteinnya. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford 1976.

3.3.1.2 Analisis Komposisi Kimia Kopi

Analisis komposisi kimia kopi terdiri atas pengujian kadar air, kadar abu, kadar karbohidrat, kadar protein, dan kadar lemak. Prosedur pengujian analisa komposisi kimia kopi terdapat pada Lampiran 1.

3.3.2. Tahap Utama

3.3.2.1 Persiapan Substrat dan Inokulum

a. Persiapan Substrat Buah kopi diseleksi terlebih dahulu dengan memilih buah kopi yang benar-benar matang dan berwarna merah. Kemudian buah kopi dipisahkan antara kulit kulit luar dan daging buah dan biji kopi, lalu dikeringkan dengan menggunakan panas matahari selama 1-2 hari sampai kadar airnya kurang dari 13 agar tidak ditumbuhi mikroorganisme 15 sebelum digunakan pada waktunya. Kulit kopi kemudian digiling sampai berukuran kurang lebih 40 mesh. b. Persiapan inokulum Isolat bakteri yang digunakan untuk inokulum yaitu FLp1 untuk proteolitik, FLs1 untuk selulolitik dan FLx3 untuk xilanolitik. Isolat bakteri yang terdapat pada agar miring ditumbuhkan dengan goresan penuh pada cawan petri dengan media yang sesuai, isolat proteolitik pada media susu skim 1, isolat selulolitik pada media CMC 1 dan isolat xilanolitik pada media xilan 0.5 yang kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator. Inokulum dibuat dengan membiakkannya pada media cair, inokulum FLp1 dibiakkan pada media susu skim 1. Komposisi media terdapat pada Lampiran 2, Sebanyak 2-3 cork borer kultur diinokulasikan kedalam media cair yang mengandung susu skim kemudian di shaker pada kecepatan 100 rpm selama 18 jam pada suhu 30 dan 37 o Inokulum FLs1 dibiakkan pada media CMC 1 dengan komposisi media terdapat pada Lampiran 2. Sebanyak 2-3 cork borer kultur diinokulasikan ke dalam media cair. Kultur diinokulasikan secara aseptis dan di shaker pada kecepatan 100 rpm selama 18 jam pada suhu kamar dan 37 C o Inokulum FLx3 dibiakkan pada media xilan 0.5 dengan komposisi media terdapat pada Lampiran 2. Sebanyak 2-3 cork borer kultur diinokulasikan ke dalam media cair. Kultur diinokulasikan secara aseptis dan di shaker pada kecepatan 100 rpm selama 22 jam pada suhu kamar dan 37 C. o C.

3.3.2.2 Fermentasi

Sebanyak 30 gram buah kopi dengan perbandingan 1:2 kulit dan biji kopi dilembabkan dengan menggunakan akuades sebanyak 8 ml agar kadar air kulit kopi sesuai dengan kadar air awal sebelum pengeringan sehingga kadar airnya mencapai 60. Substrat lembab disterilisasi pada suhu 121 o Inokulum terdiri atas tiga kombinasi bakteri yaitu : C selama 20 menit. Substrat steril yang telah dingin diaduk agar partikelnya merata dan kemudian diinokulasi secara aseptik dengan inokulum sebanyak 10 wet basis atau sebanyak 3 ml. 1.Bakteri tunggal menggunakan inokulum proteolitik FLp1 sebanyak 3 ml. 2.Kombinasi dua spesies bakteri antara inokulum selulolitik FLs1 dan xilanolitik FLx3 yang masing-masing sebanyak 1.5 ml. 3.Kombinasi tiga spesies bakteri terdiri dari inokulum proteolitik FLp1, selulolitik FLs1, dan xilanolitik FLx3 yang masing-masing sebanyak 1 ml. Setelah itu diinkubasi pada suhu 30 dan 37 o Setelah diinkubasi sampai waktu yang sesuai dengan perlakuan waktu yang diterapkan, kulit dan biji kopi disuspensikan dengan 100 ml akuades kemudian diaduk sampai merata. Setelah diaduk, kulit dan biji kopi kemudian disaring menggunakan kertas saring sehingga terpisah antara cairan dengan kulit dan biji kopi. Setelah itu dilakukan pemisahan biji kopi pada kertas saring. Biji kopi disimpan pada lemari pendingin untuk kemudian dilakukan pengujian kadar kafein dan asam-asam organik menggunakan HPLC. Kulit kopi dan kertas saring dimasukkan ke dalam oven untuk mengukur C selama 4 hari. Setiap 24 jam dilakukan pengujian hasil fermentasi. 16 penyusutan bobot kulit kopi. Cairan hasil saringan disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan cairan enzim yang terdapat pada filtrat. Cairan yang didapat dilakukan pengujian terhadap aktivitas enzim, gula total, gula pereduksi dan protein terlarutnya. 17

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 TAHAP PENDAHULUAN

4.1.1 Pemilihan Bakteri Protelitik Terbaik

Isolat bakteri proteolitik yang digunakan terdiri atas dua isolat yaitu FLp1 dan FLp2. Kedua isolat ini ditumbuhkan dalam media yang mengandung susu skim 1. Penyediaan sumber karbon dan kondisi fisik diperlukan untuk menghasilkan pertumbuhan yang optimum agar kedua isolat mampu memanfaatkan media skim sebagai media pertumbuhannya. Penentuan pertumbuhan bakteri berdasarkan pengukuran biomassa secara tidak langsung berdasarkan kerapatan optik optical density. Pengukuran biomassa bertujuan untuk mengetahui pola pertumbuhan dari isolat yang ada. Banyaknya biomassa di dalam larutan sebanding dengan besarnya absorbansi yang diperoleh dari hasil pengukuran spektrofotometer. Semakin besar absorbansi larutan yang diperoleh maka jumlah biomassa di dalam larutan semakin banyak. Kurva pertumbuhan dan aktivitas enzim proteolitik dijelaskan pada Gambar 4. Gambar 4. Kurva pertumbuhan dan aktivitas enzim bakteri proteolitik pada media skim 1 yang diinkubasi pada suhu 30 o C Pada awal pengukuran terbentuk daerah kurva yang konstan antara absorbansi dengan pertambahan waktu inkubasi. Daerah ini dikenal sebagai fase adaptasi bakteri terhadap media. Setelah fase adaptasi, bertambahnya waktu inkubasi menyebabkan peningkatan absorbansi yang cukup besar menyerupai kurva logaritmik. Pada fase ini jumlah biomassa di dalam larutan media meningkat pesat hingga mencapai maksimum. Hal ini disebabkan nutrisi bakteri yang ada pada media susu skim masih cukup melimpah. Fase ini dikenal dengan fase eksponensial. Fase eksponensial merupakan fase dimana bakteri mengalami pertumbuhan yang optimal atau suatu periode pertimbuhan bakteri yang cepat. Berdasarkan kurva tumbuh diatas, isolat FLp1 mulai memasuki fase eksponensial pada jam ke-12. Isolat FLp2 mulai memasuki fase eksponensial pada jam ke-6. Perbedaan pertumbuhan bakteri ini menunjukkan adanya keanekaragaman fisiologis dan respons yang berbeda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya Pelczar dan Chan, 2007. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 6 12 18 24 30 36 42 48 54 A k tiv it as en zim u n it m l OD Waktu jam Kurva tumbuh FLp1 Kurva tumbuh FLp2 Aktivitas enzim FLp1 Aktivitas enzim FLp2