24 glukosa, ramnosa, galaktosa dan gentiobiosa sehingga glikosida tersebut masing-
masing disebut glukosida, ramnosida, galaktosida dan gentiobiosida. Flavonoida dapat ditemukan sebagai mono, di atau triglikosida dimana
satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoida terikat oleh gula. poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam pelarut organik seperti eter,
benzen, kloroform dan aseton.
2.2.3 Glikosida
Glikosida adalah suatu senyawa yang jika dihidrolisis akan menghasilkan bagian gula yang disebut glikon dan bagian bukan gula disebut aglikon. Gula
yang dihasilkan biasanya adalah glukosa, ramnosa dan lain sebagainya. Jika bagian gulanya adalah glukosa maka disebut glukosida, sedangkan jika bagian
gulanya selain glukosa disebut glikosida. Menurut farnsworth 1996, pembagian glikosida berdasarkan atom yang
menghubungkan bagian gula dan bagian bukan gula adalah sebagai berikut: 1. O-glikosida: jika bagian gula dan bukan gula dihubungkan oleh atom O.
2. S-glikosida: jika bagian gula dan bukan gula dihubungkan oleh atom S. 3. N- glikosida: jika bagian gula dan bukan gula dihubungkan oleh atom N.
4. C-glikosida: jika bagian gula dan bukan gula dihubungkan oleh atom C.
2.3 Metode ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu kegiatan penelitian kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut sehingga menggunakan
pelarut cair.
Universitas Sumatera Utara
25 Ada beberapa cara ekstraksi menggunakan pelarut antara lain:
1. Cara dingin
a. Maserasi
Maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengadukan dan pendiaman pada temperatur ruangan.
Sedangkan remaserasi adalah pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya.
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru sampai sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan, serbuk simplisia
yang akan diperkolasi tidak langsung dimasukkan kedalam bejana perkolator, tetapi dibasahi atau dimaserasi terlebih dahulu dengan cairan penyari sekurang-
kurangnya 3 jam. Bila serbuk simplisia tersebut langsung dialiri dengan cairan penyari, maka cairan penyari tidak dapat menembus ke seluruh sel dengan
sempurna. 2.
Cara panas a.
Refluks Refluks adalah ekstraksi menggunakan pelarut pada temperatur titik
didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingan balik.
b. Sokletasi
Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru, umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dan
jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
Universitas Sumatera Utara
26 c.
Digesti Digesti adalah maserasi kinetik dengan pengadukan kontinu pada
temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan kamar yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50
C. d.
Infus Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air
bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98 C
selama waktu tertentu 15-20 menit. e.
Dekok Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama
≥ 30 C dan temperatur
sampai titik didih air Depkes, 2000.
2.4 Kromatografi
Kromatrografi adalah metode pemeriksaan berdasarkan proses minggrasi dari komponen-komponen senyawa diantara dua fase yaitu fase diam dan fase
gerak. Fase gerak membawa zat terlarut melalui media sehingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau lebih akhir, umumnya zat terlarut
dibawah melalui media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut toluena. Fase diam dapat bertindak sebagai penyerap, seperti
alumina dan slika gel atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam proses ini suatu lapisan cairan pada
penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam Ditjen POM, 1995. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari
fase diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fase diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zat cair disebut kromatografi
Universitas Sumatera Utara
27 partisi. Karena fase gerak dapat berupa zat cair atau gas maka terdapat empat
macam sistem kromatografi, yaitu : 1.
Fase gerak cair-fase diam dan padat kromatografi serapan : • Kromatografi lapis tipis
• Kromatografi kolom 2.
Fase gerak gas-fase diam padat : • Kromatografi gas padat
3. Fase gerak cair-fase diam cair kromatografi partisi :
• Kromatografi kertas 4.
Fase gerak gas-fase diam cair : • kromatografi gas cair
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa-senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam
dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain Sastrohamidjojo,1991.
2.4.1 Kromatografi kertas
Kromatografi kertas merupakan kromatografi partisi dimana fase geraknya adalah air yang disokong oleh molekul-molekul selulosa dari kertas. Kertas yang
digunakan adalah kertas Whatman No.1 dan kertas yang lebih tebal Whatman No. 3 biasanya untuk pemisahan campuran dalam jumlah yang lebih besar karena
dapat menampung lebih banyak cuplikan Sastrohamidjojo, 1991. Fase gerak yang digunakan biasanya campuran dari suatu komponen
organik yang utama air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa atau pereaksi-pereaksi kompleks dengan tujuan untuk memperbesar kelarutan dari
Universitas Sumatera Utara
28 beberapa senyawa atau untuk
mengurangi kelarutan yang lainnya Sastrohamidjojo, 1991.
Fase gerak terdiri dari satu atau beberapa pelarut dan bila diperlukan dapat menggunakan sistem pelarut multi komponen, berupa suatu campuran sederhana
mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Pada pemisahan senyawa organik selalu menggunakan pelarut campur, tujuannya untuk memperoleh
polaritas yang tepat sehinga diperoleh pemisahan senyawa yang baik. Kombinasi pelarut berdasarkan atas polaritas masing-masing pelarut sehingga dengan
demikian diperoleh sistem penggabung yang cocok Stahl, 1985. Jarak pengembang senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan
dengan harga Rf Stahl, 1985. Rf =
Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik pentotolan diukur dari pusat bercak dan harga Rf berada antara 0,00–1,00. Harga Rf sangat beguna untuk
mengidentifikasi suatu senyawa Eaton, 1989. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah sebagai berikut:
Sastrohamidjojo,1991. 1.
Struktur kimia senyawa yang dipisahkan 2.
Sifat penyerap 3.
Tebal dan kerataan lapisan penyerap 4.
Pelarut dan drajat kemurniannya 5.
Drajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana 6.
Teknik percobaan 7.
Jumlah cuplikan yang digunakan Jarak perambatan bercak dari titik pentotolan
Jarak perambatan pelarut dari titik pentotolan
Universitas Sumatera Utara
29 Menurut Sastrohamidjojo 1991, kromatografi kertas dapat
dikembangkan dengan cara : 1.
Menurun desendens Dilakukan dengan membiarkan fase gerak merambat turun pada kertas
kromatografi, kertas digantungkan dalam bejana menggunakan batang kaca dan batang kaca lain menahan ujung atas kertas yang tercelup dalam fase gerak.
Setelah bejana ditutup, fase gerak dibiarkan merambat turun pada kertas Depkes, 1979.
2. Menaik esendens
Kertas digantung pada penggantung berbentuk kail yang dipasang pada penutup bejana kromatografi. Pelarut diletakkan pada bagian bawah dari bejana
lalu ujung bawah kertas dicelupkan ke dalam fase gerak sehingga fase gerak merambat naik pada kertas.
3. Mendatar
Kertas yang digunakan berbentuk bulat dan ditengahnya diberi lubang tempat untuk meletakkan sumbu yang terbuat dari gulungan kertas atau benag.
Fase gerak akan naik membasahi kertas dan merambat melingkar memisahkan senyawa yang ditotolkan.
Kromatografi kertas merupakan metode yang paling sering digunakan dalam hal analisis senyawa polar flavonoida. Untuk tujuan isolasi, hanya memerlukan
sejumlah bahan yang sedikit. Komponen senyawa flavonoid umumnya mudah dipelajari dengan metode kromatografi karena sifatnya yang menghasilkan warna
dari hubungan sifat kelarutannya. Adapun kelebihan kromatografi kertas yaitu senyawa flavonoida dapat menghasilkan warna alami dari berbagi komponen
Universitas Sumatera Utara
30 senyawa bila dilihat dibawah sinar ultraviolet yang mudah diamati pada kertas.
Kedua, tekniknya mudah dipelajari, memberikan hasil yang cepat dan memerlukan peralatan yang tidak mahal. Selain itu, metode kromatografi kertas
merupakan cara terbaik untuk mengidentifikasi campuran senyawa flavonoida dengan jumlah yang sedikit Gaissman, 1962.
2.5 Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometri ultraviolet adalah suatu metode spektrofotometri serapan dengan cara mengukur serapan radiasi elektromagnetik suatu larutan pada panjang
gelombang tertentu. Spktrum ultraviolet digambarkan sebagai hubungan antara panjang gelombang frekuensi serapan dengan insensitas serapan transmitansi
atau absorbansi Sastrohamidjojo, 1985 Apabila suatu molekul menyerap radiasi ultraviolet, maka didalam
molekul tersebut terjadi perpindahan atau tranmisi tingkat energi elektron-elektron ikatan diorbital molekul paling luar dari tingkat energi yang lebih mudah orbital
ikatan π ketingkat energi yang lebih tinggi orbital anti ikatan π . Keuntungan
dari serapan ultraviolet adalah selektifnya dimana gugus-gugus yang khas dapat dikenal dalam molekul-molekul yang sangat kompleks Noerdin, 1985.
Serapan molekul didalam daerah ultraviolet bergantung pada struktur elektronik dari molekul, apabila suatu molekul menyerap radiasi ultraviolet
didalam molekul terjadi perpindahan tingkat energi elektron-elektron ikatan pada orbital molekul paling luar dari tingkat energi yang lebih rendah ketingkat energi
yang lebih tnggi Silverstein, 1986 .
Universitas Sumatera Utara
31
Penggunaan pereaksi geser shift reagent dalam spektrofotometri
ultraviolet untuk menganalisis struktur flavonoida
Spektrofotometri UV adalah cara yang paling berguna untuk menganalisis struktur flavonoida, biasanya ditentukan dalam larutan dengan
pelarut metanol atau etanol. Spektrum senyawa flavonoida terdiri atas dua pita absorbsi maksimum, yaitu pita I pada rentang 300-550 nm dan pita II pada 240-
285 nm. Pita I menunjukkan absorbsi system benzoil pada cincin A Markham, 1988.
Rentang serapan maksimum spectrum UV beberapa senyawa flavonoida menurut Markham 1988 adalah :
Pita II nm Pita I nm Jenis Flavonoida
250-280 250-280
250-280 245-275
275-295 230-270
230-270 270-280
310-350 330-350
350-385 310-330
300-330 340-390
380-430 465-560
Flavon Flavonol 3-OH tersubstitusi
Flavonol 3-OH bebas Isoflavon
Flavonon dan dihidroflavonol Khalkon
Auron Antosianin
Universitas Sumatera Utara
32 Spektrum serapan UV beberapa jenis golongan flavonoida menurut
Markham 9818 adalah :
Kedudukan gugus hidroksi fenol bebas pada inti flavonoida dapat ditentukan dengan menambahkan pereaksi geser ke dalam larutan cuplikan dan
mengamati puncak serapan yang terjadi Markham, 1988. Langkah pertama yang dilakukan dalam menafsirkan spectrum yaitu
menentukan jenis flavonoida dengan memperhatikan : 1.
Bentuk umum spectrum dalam methanol 2.
Panjang gelombang pita serapan 3.
Data kromatografi kertas
Universitas Sumatera Utara
33 Langkah kedua adalah memperhatikan arti perubahan spektrum yang
disebabkan oleh penembahan berbagai pereaksi geser Markham, 1988.
Spektrum natrium metoksida
Natrium metoksida merupakan basa kuat yang dapat mengionisasi hampir semua gugus hidroksi pada inti flavonoida. Spektrum ini biasanya merupakan
petunjuk sidik jari pola hidroksilasi dan juga bermanfaat untuk mendeteksi gugus hidroksi yang lebih asam dan tidak tersubstitusi. Degradasi atau pengurangan
kekuatan spektrum setelah waktu tertentu merupakan petunjuk baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa. Pereaksi pengganti natrium metoksida yang cocok
ialah larutan NaOH 2 M dalam air Mabry, 1970.
Spektrum AlCl
3
dan AlCl
3
HCl
AlCl
3
membentuk kompleks tahan asam dengan gugus hidroksi pada C
3
atau C
5
dan keton, juga membentuk kompleks tak tahan asam dengan gugus orto- dihidroksi, sehingga dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut.
Spektrum AlCl
3
HCl hanya berguna untuk mendeteksi gugus hidroksi yang bertetangga dengan gugus keton, karena gugus tersebut dengan AlCl
3
akan membentuk senyawa kompleks yang tahan asam Mabry, 1970
Spektrum natrium asetat
Natrium asetat hanya menyebabkan pengionan yang berarti pada gugus hidroksil flavonoida yang paling asam. Jadi natrium asetat digunakan terutama
untuk mendeteksi adanya gugus 7-hidroksil bebas atau yang setara Mabry, 1970
Universitas Sumatera Utara
34
Spektrum natrium asetatasam borat
Natrium asetat dan asam borat menjebatani kedua gugus hidroksi pada
gugus orto-dihidroksi dan membentuk senyawa chelat, sehingga pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi adanya gugus orto-dihidroksi pada senyawa
flavonoida Mabry, 1970.
Universitas Sumatera Utara
35
BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang dilakukan pada tumbuhan ini adalah metode eksperimental yang meliputipengumpulan, penyiapan sampel, identifikasi, pembuatan simplisia,
pemeriksaan karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis kromatografi kertas, uji kemurnian isolat dan karakterisasi isolat
spektrofotometri ultraviolet menggunakan pereaksi geser shift reagent.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, cawan penguap, blender National, oven listrik, Fisher scientific,
neraca kasar Ohaus, neraca analitik Mettler tolede, penguap vakum putar, penangas air, eksikator, seperangkat alat penetapan kadar air, lampu UV 366 nm,
bejana kromatografi dan spektrofotometer UV Shimadzu QP-5000 dan mikroskop Olympus.
3.2 Bahan-bahan
Bagian tumbuhan yang digunakan adalah daun pacar air Semua bahan- bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro
analisis yaitu etanol hasil destilasi, air suling, metanol, raksa II klorida, kalium iodida, natrium hidroksida, iodium, bismuth III nitrat, asam asetat glasial, besi
II klorida, aluminium III klorida, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, asam nitrat, asam asetat anhidrat, asam asetat glasial, amil alkohol,
isopropanol, kloroform, benzen, n-heksana, etilasetat, natrium asetat, n-butanol, ά-
naftol, serbuk magnesium, toluen, kloralhidrat, kertas saring, kertas perkamen, aluminium foil, tisu lensa dan kertas Whatman No. 3.
Universitas Sumatera Utara