35
BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang dilakukan pada tumbuhan ini adalah metode eksperimental yang meliputipengumpulan, penyiapan sampel, identifikasi, pembuatan simplisia,
pemeriksaan karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis kromatografi kertas, uji kemurnian isolat dan karakterisasi isolat
spektrofotometri ultraviolet menggunakan pereaksi geser shift reagent.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, cawan penguap, blender National, oven listrik, Fisher scientific,
neraca kasar Ohaus, neraca analitik Mettler tolede, penguap vakum putar, penangas air, eksikator, seperangkat alat penetapan kadar air, lampu UV 366 nm,
bejana kromatografi dan spektrofotometer UV Shimadzu QP-5000 dan mikroskop Olympus.
3.2 Bahan-bahan
Bagian tumbuhan yang digunakan adalah daun pacar air Semua bahan- bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro
analisis yaitu etanol hasil destilasi, air suling, metanol, raksa II klorida, kalium iodida, natrium hidroksida, iodium, bismuth III nitrat, asam asetat glasial, besi
II klorida, aluminium III klorida, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, asam nitrat, asam asetat anhidrat, asam asetat glasial, amil alkohol,
isopropanol, kloroform, benzen, n-heksana, etilasetat, natrium asetat, n-butanol, ά-
naftol, serbuk magnesium, toluen, kloralhidrat, kertas saring, kertas perkamen, aluminium foil, tisu lensa dan kertas Whatman No. 3.
Universitas Sumatera Utara
36
3.3 Pembuatan larutan pereaksi 3.3.1 Larutan pereaksi Mayer
Sebanyak 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling kemudian ditambahkan larutan 1,36 g merkuri II klorida dalam 60 ml air suling. Larutan dikocok dan
ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.3.2 Larutan pereaksi Dragendrof
Sebanyak 8 g bismut nitrat dilarutkan dalam asam nitrat 20 ml kemudian dicampur dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50 ml air suling.
Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml.
3.3.3 Larutan pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambah 2 g iodium sambil diaduk sampai larut, lalu ditambah air suling hingga
100 ml.
3.3.4 Larutan pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α- naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya
hingga diperoleh larutan 100 ml.
3.3.5 Larutan pereaksi Liebarmann-Bourchard
Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat dan 50 bagian kloroform. Larutan pereaksi ini harus dibuat baru.
3.3.6 Larutan pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml kemudian disaring.
Universitas Sumatera Utara
37
3.3.7 Larutan pereaksi timbal II asetat
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air hingga 100 ml.
3.3.8 Larutan pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh larutan 100 ml.
3.3.9 Larutan pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml.
3.3.10 Larutan aluminium III klorida 5
Sebanyak 5 g aluminium III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 100 ml Harborne, 1989.
3.4 Pengumpulan sampel, identifikasi tumbuhan dan pengolahan sampel 3.4.1 Pengumpulan sampel
Pungumpulan sampel dilakukan secara purposif, tanpa membandingkan tumbuhan serupa didaerah lain. Sampel yang digunakan adalah daun tumbuhan
pacar air Impatiens balsamina L. yang bunganya berwarna ungu, diambil dari lahan kosong jalan Gaperta Ujung, Medan. Gambar tumbuhan dan daun tumbuhan
pacar air dapat dilihat pada lampiran I halaman 39.
3.4.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Balai Penelitian dan Pengembangan Botani, Puslitbag Biologi–LIPI, Bogor. Hasil identifikasi tumbuhan yang diteliti
adalah jenis Impatiens balsamina L, suku Balsaminaceae. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 40.
Universitas Sumatera Utara
38
3.4.3 Pengolahan sampel
Daun tumbuhan pacar air Impatiens balsamina L. yang telah dikumpulkan dan dibersihkan dari pengotoran dengan menggunakan air bersih,
ditiriskan, ditimbang sebagai berat basah, kemudian dikeringkan di dalam lemari pengering lalu ditimbang, sebagai berat kering. Sampel selanjutnya diserbuk
dengan menggunakan blender lalu disimpan di dalam wadah plastik tertutup. Gambar simplisia daun dan simplisia serbuk pacar air dapat dilihat pada lampiran
3 halaman 40.
3.5 Pemeriksaan karakteristik sampel
Pemeriksaan karakteristik sampel meliputi pemeriksaan makroskopik, pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar air, pemeriksaan kadar sari yang larut
dalam air, pemeriksaan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam Material Medika
Indonesia, 1989.
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap simplisia daun tumbuhan pacar air meliputi bentuk, bau, rasa dan warna. Hasil dapat dilihat pada lampiran 4
tabel 1 halaman 41.
3.5.2.Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap simplisia dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia diatas kaca objek yang telah diteteskan dengan
larutan kloral hidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian dilihat dibawah mikroskop. Untuk memudahkan pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia maka
Universitas Sumatera Utara
39 dilakukan pemeriksaan mikroskopik irisan melintang daun pacar air. Pemeriksaan
mikroskopik dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 42
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat meliputi labu alas bulat 500 ml, penampung, tabung penerima 5 ml bersekala
0,05 ml, pendingin, tabung penyambung dan pemanas. Cara penetapan :
Ke dalam labu bulat dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam, biarkan mendingin selama 30 menit dan volume air pada
tabung penerimaan dibaca. Kemudian ke dalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15
menit. Setelah toluen mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur, kurang lebih 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air terdestilasi. Kemudian kecepatan destilasi
dinaikkan hingga 4 tetes perdetik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen yang telah dijenuhkan. Destilasi dilanjutkan
selama 5 menit, kemudin tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan
ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa WHO, 1992.
3.5.4 Penetapan kadar abu total
Sebanyak lebih kurang 2 g sampai 3 g zat yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Krus dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis,
Universitas Sumatera Utara
40 kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu
total dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara WHO, 1992.
3.5.5 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang telah diperoleh dari penetapan kadar abu total didihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit. Bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan hingga bobot tetap kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara WHO, 1992.
3.5.6 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk di maserasi selama 24 jam dalam 100 ml air- kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml, dalam labu bersumbat
sambil sesekali dikocok selam 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam
cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam open pada 105
C sampai diperoleh bobot konstan kadar sari yang larut di dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Material Medika Indonesia,
1989.
3.5.7 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara di maserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
6 jam pertama dan dibiarkan selama 18 jam. Disaring, 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara kemudian
sisanya dipanaskan dalam open pada 105 C sampai diperoleh bobot tetap. Hitung
kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 95, dihitung terhadap bahan
Universitas Sumatera Utara
41 yang telah dikeringkan di udara Material Medika Indonesia, 1989. Perhitungan
hasil karakteristik simplisia dapat dilihat pada lampiran 6 halaman 43.
3.6 Skrining fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbag sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut : a.
Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b.
Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c.
Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendrof Alkaloida dianggap positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau
tiga dari percobaan diatas Depkes, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia kemudian ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat yang
diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu ditambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif
jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol. Farnsworth, 1966.
3.6.3 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
42
3.6.4 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volume air suling 7:3,
direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml timbal II asetat 0,4 N, dikocok, didiamkan selama 5 menit
lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform P dan 2 bagian volume isopropanolol P. Pada lapisan
kloroform ditambahkan natrium sulfat anhidrat P secukupnya disaring, dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
C. Dilarutkan sisanya dengan 2 ml metanol, kemudian diambil 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish, ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat terbentuk cincin
warna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula Depkes,1995.
3.6.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik, terbentuk buih atau busa yang selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm. pada penambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, apabila
buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin Depkes, 1995
3.6.6 Pemeriksaan steroida triterpenoida
Sebanyak 1 g sampel di maserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2
tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu atau
Universitas Sumatera Utara
43 merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroida
triterpenoida Harborne, 1978. Hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada lampiran 7 tabel 3 halaman 49.
3.6.7 Pemeriksaan minyak atsiri
Dilakukan secara mikroskopik dapat dilihat dibawah mikroskop yang memberikan tetesan-tetesan minyak.
3.7 Pembuatan ekstrak
Sebanyak 400 g sebuk simplisia dimasukkan kedalam bejana tertutup dan dibasahi dengan cairan penyari etanol 96 , direndam selama 3 jam. Massa
dipindahkan sedikit-sedikit kedalam perkolator, kemudian cairan penyari dituangkan sampai semua simplisia terendam dan terdapat selapis cairan penyari
di atasnya, perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam kemudian kran perkolator dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan
kecepatan 1 ml permenit, cairan penyari ditambah berulang-ulang sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia, sampai cairan yang keluar tidak
berwarna lagi, jika cairan diuapkan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap vakum putar pada temperatur tidak lebih
50 C hingga diperoleh ekstrak kental. Dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 53
metode penelitian pada lampiran 9 halaman 51.
3.8 Ektraksi cair-cair senyawa flavonoida terhadap ekstrak etanol
Kategori