3. METODOLOGI
3.1 Waktu dan lokasi penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Februari - September 2009 dan Oktober 2010 - Desember 2010. Sampel karang lunak Lobophytum strictum diperoleh dari
rak fragmentasi buatan yang berada di Area Perlindungan Laut pada koordinat 05
o
44’03,7” LS dan 106
o
36’42,5” BT dan daerah tubir laut di selatan Pulau Pramuka, Kepulauan Seribu. Pembuatan dan pengamatan preparat histologis dari
sampel dilakukan di Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Gambar 7. Peta lokasi penelitian di perairan Pulau Pramuka 18
3.2 Alat dan bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian mengenai reproduksi karang lunak ini dibagi menjadi dua bagian, yaitu alat dan bahan yang digunakan
untuk pengambilan sampel di lapang dan untuk pembuatan preparat dan pengamatan histologis di laboratorium. Alat dan bahan yang digunakan selama
penelitian ini disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian Alat
Bahan Pengambilan Sampel
Peralatan SCUBA Formalin 10
Kapal motor Karang lunak Lobophytum
strictum Pisau Selam
Botol sampel Pembuatan Preparat dan Pengamatan Histologis
Alat pemanas air Eyela Water Bath SB-650 Formalin 10
Botol film Karang lunak Lobophytum
strictum Basket jaringan
Air kran Blok kayu
Air destilasi Pisau dan cutter
Formalin 37 Pinset
Asam Formik Jarum
Asam Klorida Lemari Asam
Etanol 70, 80, 90, 95 dan 100
Embedding Console Tissue-Tek TEC Parafin
Inkubator Eyela Soft Incubator SLI-450N Enthellan
Inkubator Memmert Pewarna Hematoxylin dan
Eosin Mikrotom Spencer 820
Xylol Gelas objek dan cover glass
Mikrometer objektif dan okuler Mikroskop cahaya dan stereo Olympus
CH20 Tutup Pagoda
Kertas Label Tisu
Alat tulis : pensil dan spidol permanen
3.3. Metode kerja 3.3.1 Preparat Histologis
1 Pengambilan Sampel Karang Lunak
Sampel karang lunak Lobophytum strictum diambil dari karang non fragmentasi alam dan hasil fragmentasi buatan pada dua kedalaman berbeda
yaitu 3 dan 12 meter. Pengambilan sampel karang lunak dilakukan dengan memotong koloni karang lunak secara acak menggunakan pisau atau cutter
kemudian disimpan dalam botol sampel dan difiksasi dengan formalin 10 . Sampel karang lunak hasil fragmentasi diambil pada usia 8 bulan pengambilan
sampel tahap 1 dan 10 bulan pengambilan sampel tahap 2. Pengambilan sampel dilakukan berdasarkan siklus bulan menurut penanggalan bulan
Qomariyah yang dibagi dalam empat fase bulan, yaitu : a. Fase bulan baru sampai bulan ¼ pertama hari 1-7
b. Fase bulan ¼ pertama sampai bulan purnama hari 8-14 c. Fase bulan purnama sampai bulan ¼ ketiga hari 15-21
d. Fase bulan ¼ ketiga sampai bulan gelap hari 22-28 Total cabang koloni yang digunakan untuk penelitian ini berjumlah 72
cabang, dengan pembagian sebesar 36 cabang dari tiap tahap pengambilan. Tiga cabang koloni dengan asal koloni berbeda baik dari karang lunak non fragmentasi
maupun hasil fragmentasi pada kedalaman 3 dan 12 meter diambil pada setiap fase bulan dari dua tahap pengambilan.
2 Pembuatan preparat histologis
Pembuatan preparat histologis untuk pengamatan dilakukan dengan metode parafin Gunarso, 1989 dan Kiernan, 1990. Tahapan-tahapan pembuatan
preparat adalah sebagai berikut : 1 Pemotongan sampel karang lunak dengan ukuran yang sesuai untuk dijadikan preparat; 2 Dekalsifikasi sampel yang telah
difiksasi dengan menggunakan larutan campuran antara HCl absolut, Formalin 37, Asam Formik dengan komposisi 0,5 : 0,5 : 0,25 yang ditambahkan air
destilasi hingga 100 ml selama ± 12 jam ; 3 Dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat 70
– 100 ; 4 Penjernihan clearing menggunakan xylol sebanyak tiga kali ulangan; 5 Infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan parafin
cair dalam inkubator bersuhu 65 C selama tiga kali ulangan; 6 Embedding atau
penanaman sampel karang lunak menggunakan parafin cair; 7 Pendinginan dan penempelan parafin pada blok kayu; 8 Pemotongan jaringan sectioning
menggunakan mikrotom putar dengan ketebalan ± 5μm; 9 Penempelan sayatan
jaringan lunak pada kaca preparat; 10 Deparaffinisation menggunakan xylol sebanyak tiga kali ulangan masing-masing selama ± 3menit ; 11 Rehidrasi
menggunakan alkohol bertingkat 100-70 masing-masing selama 3 menit dan air kran dan akuades masing-masing selama 5-10 menit ; 12
Pewarnaan menggunakan pewarna Hematoksilin-Eosin; 13 Dehidrasi dengan alkohol
bertingkat; 14 Penjernihan dengan xylol sebanyak tiga kali ulangan; 15 Mounting dengan menggunakan entelan.
3.3.2 Pengamatan perkembangan oosit
Pengamatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Pengamatan dilakukan
menggunakan mikroskop dengan perbesaran lensa sebesar 400x untuk memperoleh data :
a. Tahap perkembangan oosit Perkembangan oosit diamati berdasarkan ciri morfologi dan ukurannya.
b. Jumlah rata-rata oosit per lapang pandang Jumlah oosit ditentukan berdasarkan jumlah rata-rata telur terbanyak yang
ditemukan dalam lima lapang pandang pada tiga sayatan berseri dari tiap cabang koloni.
c. Diameter oosit Panjang oosit diukur pada bagian oosit yang paling panjang dan lebarnya
diukur secara tegak lurus terhadap panjangnya. Data panjang dan lebar oosit kemudian dirata-rata menjadi data diameter oosit. Untuk setiap tahap
perkembangan oosit diambil 50 sampel secara acak untuk diukur diameternya.
3.3.3 Pengukuran Parameter Lingkungan
Parameter lingkungan yang diukur adalah parameter fisika dan kimia yang dilakukan secara in situ dan pengamatan melalui analisis laboratorium. Parameter
fisika – kimia yang diukur, satuan, dan alatmetode yang digunakan dalam
pengukuran parameter lingkungan dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Parameter fisika dan kimia perairan yang diukur No
Parameter Satuan
Pengukuran AlatMetode
Parameter Fisika 1 Suhu
o
C in situ
Termometer Hg 2 Kecepatan arus
cms in situ
Floating droadge
3 Kedalaman meter
m in situ
Depth gauge Parameter Kimia
1 Salinitas
o oo
in situ Refraktometer
2 Derajat
keasaman pH
laboratorium pH meter 3 Oksigen terlarut
mgl in situ
Titrasi Winkler 4 Fosfat
mgl laboratorium Spektrofotometer
5 Nitrat mgl
laboratorium Spektrofotometer
3.4. Analisis data
Perkembangan dan jumlah oosit karang lunak Lobophytum strictum dianalisis dengan melakukan pengamatan preparat histologi secara visual dengan
mikroskop dan gambar hasil mikrofotografi berdasarkan fase bulan, pengaruh fragmentasi dan non fragmentasi, serta kedalaman fragmentasi dan
membandingkannya dengan pustaka terbaru atau jurnal. Jumlah oosit diukur dengan menghitung rata
–rata jumlah oosit terbanyak yang ditemukan pada lima lapang pandang di tiga sayatan berseri koloni sampel.
Data jumlah oosit sampel yang diperoleh kemudian dianalisis secara statistik menggunakan uji-F dua sampel. Langkah pertama adalah melakukan pengujian
mengenai asumsi homogenitas ragam populasi menggunakan uji-F dengan selang kepercayaan 95 untuk mengetahui jenis uji-t yang harus digunakan.
Jika F
hit
F
tabel
maka tolak H
o
yang berarti ragam populasi diasumsikan tidak sama sehingga uji yang digunakan adalah uji-t dengan asumsi ragam tidak
homogen. Jika F
hit
F
tabel
maka gagal tolak H
o
yang berarti ragam populasi diasumsikan sama maka digunakan uji-t dengan asumsi ragam homogen.
Kedua uji-t yang dipakai menggunakan selang kepercayaan 95. Apabila nilai t
hit
t
tabel
maka tolak H
o
yang berarti ada perbedaan nyata pada perkembangan reproduksi seksual karang lunak terhadap pengaruh kedalaman dan
fragmentasi buatan.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Kondisi Lingkungan Perairan Lokasi Penelitian
Pengukuran parameter fisika dan kimia yang dilakukan di lapangan dan di laboratorium secara rinci disajikan dalam Tabel 3. Parameter fisika dan kimia
yang diukur menunjukkan nilai dengan kisaran yang tidak terlalu jauh berbeda pada tahap 1 dan tahap 2 pengambilan sampel.
Tabel 3. Hasil pengukuran parameter fisika dan kimia perairan
Parameter Satuan
Nilai Baku Mutu
Kualitas Air Tahap 1
Tahap 2 Suhu
o
C 28-30
3 meter 28.7
29.5 12 meter
27.4 27.8
Kecepatan Arus cms
29.1 25.4
Salinitas
o oo
33-34 3 meter
33 33
12 meter 33
33 Derajat
keasaman pH
7-8.5 3 meter
8.08 8
12 meter 8.05
8 Oksigen terlarut
mgl 5
3 meter 5.621
5.243 12 meter
5.631 5.646
Fosfat mgl
0.015 3 meter
0.015 0.022
12 meter 0.146
0.014 Nitrat
mgl 0.008
3 meter 0.034
0.21 12 meter
0.029 0.007
Catatan : 1.
Pengamatan parameter fisika dan kimia perairan tahap 1 dilakukan pada bulan Mei 2009 dan tahap 2 pada bulan Juli 2009.
2. Baku mutu merujuk pada Keputusan Menteri Lingkungan Hidup tentang baku
mutu kualitas air untuk biota laut karang No. 179 tahun 2004
25