65 var. anguina hasil pengecambahan benih dalam media MS tanpa penambahan zat
pengatur tumbuh secara in vitro. Bibit in vitro untuk sumber eksplan dalam induksi kalus berumur ± 2 minggu setelah perkecambahan. Potongan eksplan
berukuran sekitar 1 cm ditanam dalam media perlakuan induksi kalus, dan kultur dipelihara dalam ruangan bersuhu 22 – 24
o
C dalam kondisi gelap 24 jam sehari. Kalus yang sudah terbentuk pada umur 4 minggu setelah tanam MST di panen,
ditimbang bobot segarnya dan dilakukan ekstraksi kasar protein. Daun DLP dan akar tanaman dari lapang ALP diambil dari tanaman
yang sudah berbuah berumur 2 bulan setelah tanam. Tanaman tersebut berasal dari benih yang ditanam dalam polibag berukuran 40 x 40 cm
2
dengan media campuran tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1 vv. Daun yang
diambil adalah daun yang sehat tidak ada gejala serangan penyakit dan sudah berkembang sempurna daun dewasa. Sedangkan akar yang digunakan untuk
analisis adalah akar primer, sekunder maupun tertier akar serabut. Ekstrak kasar protein diisolasi dari kalus in vitro, daun dan akar tanaman
dari lapang. Metode ekstraksi protein, penentuan aktivitas kitinase dan peroksidase dilakukan dengan metode seperti pada Bab IV.
Percobaan 2. Analisis Aktivitas Kitinase dan Peroksidase pada Ekstrak Kasar
Protein Akar,
Batang dan
Daun Tanaman
T. cucumerina var. anguina dari Lapang pada Berbagai Umur Tanaman
Bahan tanaman yang digunakan terdiri dari tanaman T1 berumur 3 minggu setelah berkecambah 3 MSB, T2 tanaman berumur 1 bulan setelah
tanam 1 BST dan tanaman berumur 2 bulan setelah tanam 2 BST di polibag. Benih ditanam di bak pembibitan dan dipanen pada umur 3 minggu setelah
perkecambahan untuk tanaman 3 MSB. Untuk tanaman 1 dan 2 BST, bibit di pindah ke polibag berukuran 40 x 40 cm dengan media campuran tanah dan pupuk
kandang dengan perbandingan 1:1 vv dan tanaman dipanen akar batang dan daunnya pada umur 1 dan 2 BST.
Ekstrak kasar protein diisolasi dari dari akar, batang dan daun tanaman yang diuji. Metode ekstraksi protein, penentuan aktivitas kitinase dan peroksidase
dilakukan dengan metode seperti pada Bab IV.
66
Hasil Percobaan 1. Induksi Kalus dan Analisis Aktivitas Enzim Kitinase dan
Peroksidase dari Ekstrak Kasar Protein Asal Kalus In Vitro,
Daun dan Akar tanaman T. cucumerina var. anguina.
Pertumbuhan kalus in vitro
Kalus dapat dihasilkan pada empat komposisi media yang diuji N1B1 1
µM NAA + 1 µM BA , N2B2 2 µM NAA + 2 µM BA , N3B3 3 µM NAA + 3
µM BA dan N4B4 4 µM NAA + 4 µM BA. Namun sebagian besar kalus pada media N2B2 terkontaminasi pada minggu ke-2 sehingga pengamatan tidak dapat
dilanjutkan. Selanjutnya kalus yang dianalisis adalah dari media N1B1, N3B3 dan N4B4. Ketiga komposisi media tersebut memiliki rasio auksin dan sitokinin yang
sama namun dengan konsentrasi yang berbeda. Bobot kalus yang dihasilkan pada
ketiga komposisi media tidak berbeda nyata Tabel 9. Morfologi kalus pada 3
komposisi media yang diuji terlihat agak berbeda antara kalus pada media N1B1 dengan kalus pada media N3B3 dan N4B4 seperti terlihat pada Gambar 14. Kalus
pada media N1B1 berwarna kecoklatan sementara pada media N3B3 dan N4B4 berwarna putih dan kecoklatan pada beberapa bagiannya.
Tabel 9. Rataan bobot kalus T. cucumerina var. anguina pada 4 MST dari berbagai komposisi media MS dengan penambahan berbagai
konsentrasi NAA dan BA
Perlakuan Persentase eksplan berkalus
Jumlah akar pada kalus
Bobot kalus per eksplan g
Bobot kalus per botol g
N1B1 100 0.75 2.25
N2B2 100 -
- N3B3 100
0.64 2.06 N4B4 100
1.14 2.37
Keterangan : Kalus terkontaminasi bakteri sehingga tidak didapatkan data bobot akhir
67 Gambar 14. Representasi jaringan yang dianalisis dalam percobaan 1: a eksplan
untuk induksi kalus, b, c, d kalus pada media N1B1, N3B3 dan N4B4, e daun dan f akar tanaman dari lapang.
Total Protein Terlarut dan Kadar Protein Jaringan
Jenis bahan tanaman nyata berpengaruh terhadap rataan total protein terlarut TPT dari ekstrak kasar protein Tabel 10. TPT dari ekstrak kasar protein
daun nyata lebih tinggi dibandingkan pada akar maupun kalus. TPT pada ekstrak kasar protein kalus dari ke tiga media yang digunakan tidak berbeda nyata. TPT
pada akar tidak berbeda nyata dengan TPT pada kalus, kecuali pada kalus dari media N3B3.
Kadar protein jaringan menunjukkan jumlah protein yang terdapat dalam setiap gram bobot jaringan segar. Rataan nilai kadar protein jaringan KPJ dari
berbagai jaringan yang diuji seperti terlihat pada Tabel 10. KPJ pada berbagai jaringan tersebut mengikuti pola TPT. KPJ tertinggi ditemukan pada ekstrak kasar
protein daun tanaman yaitu mencapai 20.69 mg protein per gram bobot segar daun atau sekitar 2. KPJ paling rendah adalah pada akar tanaman dari lapang namun
tidak berbeda nyata dengan KPJ yang diperoleh dari kalus yang dihasilkan dari tiga komposisi media yang diuji dalam percobaan.
a b
c
d e f
68 Tabel 10. Rataan total protein terlarut dan kadar protein dari kalus in vitro, daun
dan akar tanaman dari lapang tanaman T. cucumerina var. anguina Bahan Tanaman
Total protein terlarut mgml
Kadar Protein Jaringan mgg BS
Kalus N1B1 0.010 b
5.18 bc Kalus N2B2
- -
Kalus N3B3 1.76 b
7.07 b Kalus N4B4
0.99 bc 3.96 bc
Daun Lapang DLP 5.17 a
20.69 a Akar Lapang ALP
0.44 c 1.78 b
Keterangan : Kalus diinduksi dalam media N1B1 1 µM NAA + 1 µM BA, N2B2 2 µM NAA + 2 µM BA, N3B3 3 µM NAA + 3 µM BA dan N4B4 4 µM NAA + 4 µM BA. BS = bobot
segar. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama dalam satu kolom tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada
α=0.05.
Aktivitas Kitinase
Hasil uji aktivitas kitinase dari ekstrak kasar protein kalus, daun dan akar tanaman disajikan pada Tabel 11. Aktivitas kitinase paling tinggi ditemukan pada
ekstrak kasar protein dari akar tanaman dari lapang dengan nilai yang nyata lebih tinggi dibanding aktivitas kitinase dari ekstrak kasar protein daun, namun tidak
berbeda nyata dengan aktivitas kitinase dari ekstrak kasar protein kalus. Aktivitas kitinase dari ekstrak kasar protein kalus dari ketiga komposisi media yang diuji
tidak berbeda nyata. Aktivitas kitinase dari ekstrak kasar protein akar mencapai hampir 39 kali lipat aktivitas kitinase pada ekstrak kasar protein daun, sementara
aktivitas kitinase dari ekstrak kasar protein kalus antara 13 – 30 kali lipat aktivitas kitinase pada ekstrak kasar protein daun.
Aktivitas kitinase dari ekstrak protein kasar tanaman per gram bobot segar jaringan tanaman nyata dipengaruhi oleh jenis jaringan tanaman seperti terlihat
pada Tabel 11. Aktivitas kitinase per gram jaringan segar sangat tergantung pada kadar protein jaringan. Makin tinggi kadar protein jaringan maka makin besar
nilai aktivitas kitinase per gram bobot segar jaringan tanaman. Aktivitas kitinase per gram bobot segar paling tinggi pada kalus dari media N4B4, dengan nilai yang
tidak berbeda nyata dengan aktivitas kitinase pada ekstrak kasar protein kalus dari media N1B1 namun berbeda nyata dengan kalus dari media N3B3.
69 Tabel 11. Rataan aktivitas kitinase per mg protein dan per gram bobot segar
berbagai jaringan tanaman T. cucumerina var. anguina
Bahan Tanaman Aktivitas kitinase
mM pNpjammg protein
Aktivitas kitinase mM pNpjamg BS
Kalus N1B1 4.03 a
22.37 ab Kalus N2B2
- -
Kalus N3B3 2.66 ab
17.03 bc Kalus N4B4
6.03 a 23.64 a
Daun Lapang DLP 0.21 b
4.67 d Akar Lapang ALP
7.70 a 11.17 c
Keterangan : Kalus diinduksi dalam media N1B1 1 µM NAA + 1 µM BA, N2B2 2 µM NAA + 2 µM BA, N3B3 3 µM NAA + 3 µM BA dan N4B4 4 µM NAA + 4 µM BA. Angka yang
diikuti oleh huruf yang sama dalam satu kolom tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada
α=0.05.
Aktivitas kitinase per mg protein paling tinggi ditemukan pada ekstrak kasar protein akar. Akan tetapi, karena rendahnya kadar protein akar, aktivitas
kitinase per gram bobot segar akar menjadi lebih kecil dibandingkan kalus. Sementara pada daun, aktivitas kitinase per mg protein jauh lebih kecil dibanding
akar dan kadar protein daun yang tinggi tidak dapat meningkatkan aktivitas kitinase per gram bobot segar daun menjadi lebih tinggi dibanding akar.
Aktivitas Peroksidase
Aktivitas peroksidase per mg protein dari ekstrak kasar protein kalus, daun dan akar tanaman dari lapang disajikan pada Tabel 12. Aktivitas peroksidase per
mg protein nyata paling tinggi pada ekstrak kasar protein akar tanaman dari lapang dan paling rendah pada ekstrak kasar protein daun tanaman. Ekstrak kasar
protein akar mencapai 19 kali lipat aktivitas peroksidase dari ekstrak kasar protein daun. Aktivitas peroksidase per mg protein dari ekstrak kasar protein kalus dari
ketiga komposisi media yang diuji tidak berbeda nyata satu sama lainnya. Sementara ekstrak kasar protein dari daun memiliki aktivitas peroksidase yang
tidak berbeda nyata dengan aktivitas peroksidase dari ekstrak kasar protein kalus dari ketiga komposisi media.
70 Tabel 12. Rataan aktivitas peroksidase per mg protein dan per gram bobot segar
berbagai jaringan tanaman T. cucumerina var. anguina
Bahan Tanaman Aktivitas peroksidase
∆420menitmg protein
Aktivitas peroksidase ∆420menitg BS
Kalus N1B1 0.10 b
0.50 b Kalus N2B2
- -
Kalus N3B3 0.10 b
0.63 b Kalus N4B4
0.16 b 0.62 b
Daun Lapang DLP 0.05 b
0.97 ab Akar Lapang ALP
0.96 a 1.58 a
Keterangan : Kalus diinduksi dalam media N1B1 1 µM NAA + 1 µM BA, N2B2 2 µM NAA + 2 µM BA, N3B3 3 µM NAA + 3 µM BA dan N4B4 4 µM NAA + 4 µM BA. Angka yang
diikuti oleh huruf yang sama dalam satu kolom tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada
α=0.05.
Aktivitas peroksidase per gram bobot segar jaringan tanaman seperti terlihat pada Tabel 12. Aktivitas peroksidase per gram bobot segar nyata
dipengaruhi oleh jenis jaringan karena antar jaringan terdapat perbedaaan kadar protein seperti disajikan pada Tabel 10. Namun pola aktivitas peroksidase per
gram bobot segar jaringan memiliki pola yang sama dengan aktivitas peroksidase per mg protein. Aktivitas peroksidase per gram bobot segar jaringan paling tinggi
adalah pada akar, nyata lebih tinggi dari kalus namun tidak berbeda nyata dengan daun.
Percobaan 2. Aktivitas Kitinase dan Peroksidase pada Ekstrak Kasar Protein Akar, Batang dan Daun Tanaman
T. cucumerina dari Lapang pada Berbagai Umur Tanaman
