Gambar 23. Media yang sudah siap
4.5.3.4 Pembiakan Spesimen
Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah spesimen stem sel Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 yang dibiakkan secara murni pada media
BHI dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil tabung yang sudah disterilkan kemudian
masukkan 10ml BHI Brot setelah itu 100µl bakteri kemudian divortex secara perlahan agar bakteri dapat menyatu dengan bahan. Tutup atas tabung dengan kapas
kemudian masukan tabung ke dalam wadah setelah itu isi wadah tersebut dengan gas CO
2
selama 1 menit dalam posisi wadah tertutup. Pengisian gas dimaksudkan untuk menciptakan suasana wadah menjadi anaerob agar bakteri dapat tumbuh. Setelah 1
menit hentikan pengisian gas yang diikuti dengan pencabutan selang dari wadah setelah itu tutup rapat wadah kemudian masukkan wadah kedalam inkubator.
4.5.3.5 Efek Antibakteri Ekstrak Bahan Dengan Metode Difusi
Menggunakan Cakram
Biakan bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah fusobacterium nucleatum. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni yang telah dikultur dan disuspensikan
dengan menggunakan larutan BHI Brot sampai diperoleh kekeruhan yang diinginkan, kemudian suspensi diusapkan merata dengan kapas lidi steril pada media dalam
cawan petri. Diperlukan 6 cawan petri untuk ekstrak batang kemuning berisi 3 buah cakram kosong yang ditetesi masing-masing 10 mikro liter ekstrak 1 2,5 5
7,5 20 dan juga kontrol. Lalu media diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Ekstrak bahan dikatakan efektif apabila zona bening terbentuk.
4.5.3.6 Cara Pengukuran Zona Bening
Zona bening yang terbentuk diukur dua kali, pengukuran berdasarkan garis tengah diagonal, dan hasilnya direratakan. Pengukuran zona bening dengan kaliper.
Gambar 24. cara mengukur zona hambat bakteri pada media BHI setelah 24 jam pengamatan.
D1 diameter zona terang
D2 diameter zona terang
Cakram berisi ekstrak sampel
Cakram
Zona hambat = D1+D2 2
2 Media BHI yang sudah
disuspensikan bakteri
4.5.3.7 Efek Antibakteri Ekstrak Bahan Dengan Metode Perhitungan Koloni Bakteri
Pada percobaan ini dilakukan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plates Miles Mesra yaitu setiap konsentrasi ekstrak etanol batang
Kemuning Murraya Paniculata setelah diinkubasi dalam waktu 3 jam dan 6 jam, kemudian diteteskan dalam petri yang sudah diberi label. Setelah diteteskan lakukan
perataan cairan dengan menggunakan plat besi yang dihangatkan pada setiap kali percobaan. Setelah mengering dimasukkan kedalam wadah yang akan diisi oleh gas
CO
2
kemudian diinkkubasi dalam inkubator dengan suhu 37
o
C selama 24 jam.
Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk
koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri
pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni
bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran dikali 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan
bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan
faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar CFUml.
4.6 Pengolahan dan Analisis Data
