MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK Pandanus conoideus Lamk VARIAN BUAH KUNING

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK

PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK P

andanus

conoideus

_Lamk

_{VARIAN BUAH KUNING}

Disusun Oleh:

KURNIA DYAH SUGESTI

M0305041

SKRIPSI

Ditulis dan Diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan mendapatkan gelar sarjana Sains Kimia

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM

UNVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

Oktober, 2010

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

HALAMAN PENGESAHAN

Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta Telah Mengesahkan Skripsi Mahasiswa:

Kurnia Dyah Sugesti M 0305041, dengan judul ”Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari Ekstrak Pandanus

conoideus Lamk Varian Buah Kuning”

Skripsi ini dibimbing oleh:

Pembimbing I

Dr.rer.nat Fajar Rakhman W,M.Si NIP 19730605 200003 1001

Pembimbing II

M. Widyo Wartono, M.Si NIP 19760822 200501 1001

Dipertahankan di depan Tim Penguji Skripsi pada:

Hari : Kamis

Tanggal : 07 Oktober 2010 Anggota Tim Penguji:

1. Dra. Tri Martini, M.Si 1... NIP 19581029 198503 2002

2. Yuniawan Hidayat, M.Si 2. ... NIP 19790605 200501 1001

Disahkan Oleh Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta

Ketua Jurusan Kimia,

Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D.

NIP 19560507 198601 1001

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul ”MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK PANDANUS CONOIDEUS LAMK VARIAN BUAH KUNING” adalah benar-benar hasil penelitian sendiri dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat kerja atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Oktober 2010

Kurnia Dyah Sugesti

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK (Pandanus conoideus

Lamk) VARIAN BUAH KUNING

KURNIA DYAH SUGESTI

Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Sebelas Maret

ABSTRAK

Buah kuning merupakan salah satu varian dari Buah Merah (Pandanus conoideus Lamk). Perbedaan utama dari ekstrak buah kuning dengan ekstrak buah merah adalah kadar asam lemak tak jenuh dan senyawa antioksidannya dimana dalam ekstrak buah merah mempunyai kadar yang lebih banyak daripada ekstrak buah kuning. Pada penelitian ini telah dilakukan pemisahan trigliserida dari ekstrak buah kuning dengan modifikasi teknik kromatografi kolom. Modifikasi dilakukan dengan menambahkan alumina basa dan agen pengoksidasi berupa MnO2 kedalam fasa diam silika gel. Elusi dilakukan dengan menggunakan fasa

gerak petroleum eter dan dietil eter. Fraksi yang dihasilkan kemudian diidentifikasi dengan menggunakan IR dan GC-MS.

Pemisahan menggunakan fasa diam silika gel-alumina (2:3) dengan penambahan MnO2 3% menghasilkan 3 fraksi. Spektra FT-IR dari fraksi pertama

menunjukkan adanya serapan yang khas untuk beberapa gugus fungsi yaitu ester dari trigliserida dan alkana rantai panjang. Spektra GC-MS menunjukkan metil ester dari asam lemak yaitu asam oleat, palmitat, dan stearat serta teridentifikasi senyawa 1-0-oktadekanoil-1,2-etanadiol dan glikol-1-palmitat yang merupakan produk tak sempurna dari oksidasi trigliseridanya. Komponen trigliserida telah terpisah dari senyawa lain dalam ekstrak buah seperti β-karoten dan tokoferol. Kedua senyawa tersebut merupakan antioksidan yang dapat mencegah oksidasi asam lemak tak jenuh. Dari hasil analisis, diketahui bahwa trigliserida dapat dipisahkan dari senyawa yang lain dengan modifikasi teknik kromatografi kolom tanpa merusak senyawa tersebut karena keberadaan senyawa antioksidan dapat melindungi trigliserida dari reaksi oksidasi.

Kata kunci: Buah kuning, modifikasi kromatografi kolom, trigliserida, senyawa antioksidan, auto-oksidasi.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

MODIFICATION OF COLUMN CHROMATOGRAPHY TECHNIQUE FOR TRIGLYCERIDES SEPARATION FROM Pandanus conoideus

LAMK VARIANT YELLOW FRUIT

KURNIA DYAH SUGESTI

Department of Chemistry, Faculty of Mathematic and Sciences Sebelas Maret University

ABSTRACT

Yellow fruit is one variant of Pandanus conoideus Lamk. The main different of yellow and red fruit extract is the concentration of unsaturated fatty acid and antioxidant agent where the red fruit much higher than yellow fruit. Triglycerides separated from yellow fruit extract using modification of column chromatography was done. The modification was done by an addition of basisch alumina and oxidizing agent that is MnO2 into stationary phase. Fractions was

obtained from separation then determined by IR and GC-MS.

Separation used stationary phase of silica gel-alumina(2:3) by an addition MnO2 3% result 3 fractions. Spectra IR from the first fraction showed the

presence of several characteristic functional groups, that is ester from triglycerides and long chain alkane. GC-MS spectrum showed metyl ester from triglycerides such as oleic acid palmitate acid, and stearate acid also new compound was identified as 1-0-octadecanoyl-1,2-ethanediol and glycol-1-palmitate which the unperfect product from triglycerides oxidation. Triglycerides have been separated from other compound in extract such as β-karoten and tokoferol. Both of them are antioxidant that prevent unsaturated fatty acid oxidation. From the analysis result, could be known that triglycerides could be separated from the other compound with modification of column chromatography without changed this compound because the antioxidant were protecting triglycerides from oxidation reaction.

Key word : yellow fruit, modification of column chromatography, triglyserides, ontioxidant agent, auto-oxidation.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user MOTTO

Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu telah selesai (dari suatu urusan), Kerjakanlah dengan sungguh-sungguh

(urusan) yang lain. (Alam Nasyrah: 6-7)

Tinta bagi seorang pelajar lebih suci nilainya daripada darah seorang martir ( Muhammad SAW)

Semua yang pasti di dunia ini adalah ketidakpastian itu sendiri dan Tuhan memelihara ketidakpastian itu pada seluruh umat manusia agar manusia

terus belajar dan terus bermimpi (Albert Einstein)

Sebaik-baiknya manusia adalah manusia yang memberi manfaat untuk orang lain

(5 cm)

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user PERSEMBAHAN

Kupersembahkan perjuangan ku ini kepada:

Ibu dan bapak yang telah memberikanku kesempatan untuk membanggakan kalian dengan cara ku Kakak dan adik tercinta yang selalu mendukungku Someone yang selalu setia menungguku ur still the one

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Skripsi yang berjudul “ Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari Ekstrak Pandanus conoideus Lamk Varian Buah Kuning ” ini disusun atas dukungan dari berbagai pihak. Dari dasar hati penulis menyampaikan terima kasih kepada:

1. Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

2. Dr.rer.nat. Fajar Rakhman Wibowo,M.Si selaku pembimbing I dan pembimbing akademik, terimakasih atas bantuan, arahan dan kesabarannya membimbing selama melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3. M. Widyo Wartono, M.Si selaku pembimbing II, yang telah memberikan bimbingan dan arahan.

4. I.F. Nurcahyo, Msi., selaku Ketua Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret.

5. Seluruh Dosen di Jurusan Kimia, Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas ilmu yang berguna dalam menyusun skripsi ini.

6. Para Laboran di Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas bantuan dan kerjasama yang baik.

7. Teman-temanku angkatan 2005 yang senantiasa mendukungku. Special thank’s for Sulis, Arini, Erma, Lenia, Okly, ijup, Sofi.

8. Semua pihak yang tidak dapat kami sebutkan satu persatu.

Semoga Allah SWT membalas jerih payah dan pengorbanan yang telah diberikan dengan balasan yang lebih baik.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dalam rangka untuk menyempurnakan skripsi ini. Akhir kata, semoga karya kecil in dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan bagi pembaca.

Surakarta, Oktober 2010

Kurnia Dyah Sugesti

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PENGESAHAN ... ii

HALAMAN PERNYATAAN ... iii

HALAMAN ABSTRAK... iv

HALAMAN ABSTRACT ... v

HALAMAN MOTTO ... vi

PERSEMBAHAN ... vii

KATA PENGANTAR ... viii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang Masalah ... 1

B. Perumusan Masalah... 2

1. Identifikasi masalah ... 2

2. Batasan masalah... 4

3. Rumusan masalah... 4

C Tujuan Penelitian ... 4

D. Manfaat Penelitian ... 5

BAB II. LANDASAN TEORI... ... 6

A. Tinjauan Pustaka ... 6

1. Buah kuning. ... 6

2. Komponen-komponen pada ekstrak buah kuning ... 7

a. Komponen trigliserida ... 8

1) Trigliserida... 8

2) Asam lemak bebas ... 9

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

3) Oksidasi asam lemak ... 10

b. Komponen non trigliserida ... 12

1) Karotenoid ... 12

2) Tokoferol ... 15

c. Aktivitas antioksidan ... 15

1) Radikal bebas... 15

2) Antioksidan... 17

3. Kromatografi ... 18

a. Kromatografi kolom ... 18

b. Alumina ... 19

c. Silika gel ... 21

4. Mangan dioksida(MnO2)... 22

B. Kerangka pemikiran ... 23

C. Hipotesis ... 24

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ... ... 25

A. Metodologi Penelitian ... 25

B. Tempat dan Waktu Penelitian ... ... 25

C. Alat dan Bahan ... ... 25

1. Alat-alat yang digunakan... ... 25

2. Bahan-bahan yang digunakan ... 26

D. Prosedur Penelitian... 26

1. Clean up sampel... ... 26

2. Pembuatan 0,5% rhodamin B dalam etanol ... 26

3. Kromatografi lapis tipis ... 26

4. Kromatografi kolom flash... 27

E.Teknik pengumpulan dan analisis data... 27

a. Pengumpulan data ... 27

b. Analisis data ... 28

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 29

A. Persiapan sampel ... 29

B. Penentuan fasa gerak dan fasa diam ... 29

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

C. Pemisahan dengan kromatografi kolom flash ... 33

D. Identifikasi senyawa ... 36

E. Pengaruh penambahan alumina dan MnO2 ... 45

F. Pengaruh keberadaan antioksidan dalam ekstrah buah kuning . 46 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN... 49

a. Kesimpulan... 49

a. Saran .. ... 49

DAFTAR PUSTAKA ... ... 50

LAMPIRAN... 54

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Beberapa asam lemak yang umum... 8 Tabel 2. Komposisi asam lemak dari minyak buah kuning ... 10 Tabel 3. Urutan kepolaran eluen, elusi senyawa dan kekuatan adsorben

dalam kromatografi ... 19 Tabel 4. Harga Rf dari spot hasil pemisahan buah kuning ... 30 Tabel 5. Harga Rf, warna dan berat total tiap fraksi ... 35 Tabel 6. Perbandingan data GC-MS dengan kandungan dalam ekstrak

buah kuning ... 44

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Buah kuning ... 6

Gambar 2. Struktur molekul monogliserida, digliserida dan trigliserida 9 Gambar 3. Reaksi kondensasi asam lemak ... 9

Gambar 4. Contoh struktur molekul asam lemak bebas (asam oleat) ... 10

Gambar 5. Mekanisme oksidasi asam lemak pada tahap inisiasi dan propagasi ... 11

Gambar 6. Konversi β-karoten ... 14

Gambar 7. Struktur α-tokoferol ... 15

Gambar 8. Struktur alumina ... 20

Gambar 9. Struktur dasar alumina a) asam, b) netral, c) basa ... 21

Gambar 10. Struktur silika gel ... 22

Gambar 11. Pengubahan vitamin A menjadi retinal oleh MnO2 ... 23

Gambar 12. Plat KLT ekstrak buah kuning dengan modifikasi Si-Al (2:3)+MnO2 a). 3% dan b). 5% ... 31

Gambar 13. Kromatografi kolom flash ... 33

Gambar 14. Grafik perubahan masa tabung hasil pemisahan dengan kromatografi kolom flash ... 34

Gambar 15. Perbandingan Rf plat silika gel awal dengan Rf dari eluat ... 35

Gambar 16. Puncak-puncak serapan analisis FT-IR terhadap fraksi pertama ... 37

Gambar 17a. Kromatogram GC-MS ekstrak buah kuning murni ... 38

Gambar 17b. kromatogram GC-MS fraksi trigliserida………. 38

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kolom kromatografi modifikasi... 54

Lampiran 2. Gambar plat pemisahan dengan silika gel dan silika+alumina (2:3)... 55

Lampiran 3. Kondisi operasi GC-MS QP2010S Shimadzu ... 56

Lampiran 4. Spektrum analisis GC-MS ekstrak buah kuning murni ... 57

Lampiran 5. Spektrum analisis GC-MS fraksi trigliserida ... 59

Lampiran 6. Spektrum FT-IR fraksi trigliserida ... 64

Lampiran 7. Bagan alir cara kerja ... 65

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) merupakan salah satu buah endemik Papua. Empat varian utama dari P. conoideus dikenal oleh masyarakat sekitar karena nilai ekonominya sebagai tanaman obat. Keempat varian P. conoideus diantaranya adalah merah panjang, merah pendek, cokelat dan kuning (Budi, 2001). Beberapa bukti empiris menunjukkan bahwa P. conoideus varian kuning (yang kemudian dikenal dengan buah kuning) dapat bertindak sebagai obat antikanker meskipun mekanisme penghambatan terhadap sel kanker oleh buah ini belum sepenuhnya dapat diketahui (Astirin, 2008).

Analisis pendahuluan terhadap ekstrak buah kuning terungkap bahwa ekstrak buah kuning mengandung: total karoten (9.500 ppm); β-karoten (240 ppm); tokoferol (10.400 ppm) dan beberapa asam lemak seperti asam oleat, asam linoleat dan asam palmitat serta omega 3 dan omega 9 yang dikenal sebagai antioksidan yang dapat mencegah berbagai penyakit termasuk kanker (Budi, 2001). Kandungan senyawa dalam buah kuning hampir sama dengan varian buah merah panjang hanya berbeda dalam komposisi asam lemak jenuhnya dan kadar asam lemak tak jenuh serta senyawa antioksidannya.

Asam lemak terdapat dalam tumbuhan terutama dalam bentuk terikat, teresterkan dengan gliserol sebagai lemak yaitu berupa triasil gliserol atau trigliserida (Harborne, 1987; Muchalal, 2004). Ikatan tak jenuh yang ada dalam asam lemak merupakan pusat aktif yang dapat bereaksi dengan oksigen. Peroksidasi (auto-oksidasi) lipida dapat menyebabkan kerusakan jaringan tubuh secara in vivo sehingga menimbulkan beberapa penyakit seperti kanker. Efek yang merusak ini ditimbulkan oleh radikal bebas (ROO*, RO*, OH*) yang dihasilkan saat pembentukan peroksida dari asam lemak. Keberadaan antioksidan dalam ekstrak buah dapat menghambat atau mencegah reaksi auto-oksidasi pada lipida. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat pada radikal peroksida (ROO*, RO*, OH*) dan mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

Autooksidasi yang terjadi pada asam lemak relatif lebih cepat apabila ekstrak lipida dalam ekstrak buah dipisahkan dari komponen senyawa yang lain. Sebaliknya apabila dilakukan pemisahan langsung dari bahan awal reaksi autooksidasinya menjadi lebih lambat. Amplifikasi yang dilakukan dengan menambahkan oksidator pada proses kolom akan dapat diketahui seberapa besar kekuatan oksidasi dari asam lemak tak jenuhnya dan ketahanan terhadap reaksi oksidasi karena keberadaan senyawa antioksidan yang terdapat pada ekstrak buah. Penelitian yang telah dilakukan pada ekstrak lipida dari ekstrak buah merah menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fasa diam modifikasi yaitu berupa silika gel-alumina (2:3) dan oksidator berupa MnO2 diperoleh hasil

suatu produk turunan asam lemak yaitu berupa dioktil phtalat dan bis(2-etilheksil) adipat (Handayani, 2008). Sedangkan ekstrak β-karoten dari buah merah juga telah dipisahkan dengan menggunakan teknik modifikasi tersebut. Modifikasi fasa diam tersebut menyebabkan senyawa β-karoten mengalami perubahan (Rumanthi, 2008).

Adanya perbedaan komposisi dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah kuning dimungkinkan berpengaruh terhadap proses pemisahan senyawanya. Kandungan asam lemak tak jenuh dalam ekstrak buah merah lebih besar daripada ekstrak buah kuning, sehingga kemungkinan asam lemak yang bereaksi dengan oksidator lebih besar pada buah merah. Berdasarkan hal tersebut, pada penelitian ini dilakukan modifikasi yang sama dengan modifikasi yang dilakukan pada ekstrak buah merah dengan memperhatikan pengaruh perbedaan kadar asam lemak dan potensi antioksidan dengan penambahan oksidator yang tinggi, apakah reaksi yang terjadi akan sekuat pada buah merah jika modifikasi ini dilakukan pada buah kuning.

B. Perumusan Masalah 1. Identifikasi Masalah

Buah kuning (Pandanus conoideus Lamk.) mengandung trigliserida dan senyawa lain seperti β-karoten dan tokoferol. Komposisi utama dalam ekstrak buah kuning didominasi oleh asam lemaknya. Kandungan asam lemak tak jenuh 2

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

dalam ekstrak buah kuning sekitar 58,018%, sedangkan kandungan asam lemak tak jenuh dalam ekstrak buah merah sekitar 65,74%. Selisih asam lemak tak jenuh dalam ekstrak buah kuning dan ekstrak buah merah sebesar 7,722%. Dalam ekstrak buah merah juga terdapat adanya asam lemak bebas. Selain komposisi asam lemak, komposisi antioksidan dalam ekstrak buah kuning juga berbeda dengan ekstrak buah merah. Total antioksidan dalam ekstrak buah kuning sebesar 20.140 ppm (2,014%), sedangkan total antioksidan dalam eksrak buah merah sebesar 23.700 ppm (2,37 %). Selisih antioksidan dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah kuning sebesar 3.560 ppm (0,356%).

Asam lemak dalam ekstrak buah kuning dapat dipisahkan dari senyawa lain dengan berbagai macam teknik pemisahan diantaranya kromatografi kolom. Penambahan alumina dalam fasa diam dapat mengakibatkan perubahan irreversibel.Alumina menyebabkan reaksi saponifikasi gliserida dan auto-oksidasi asam lemak (Schultz, 1962). Alumina untuk kromatografi berada dalam bentuk basa (pH 9,5), asam (pH 4,5 dalam air) dan netral. Alumina basa merupakan alumina yang lebih reaktif dibandingkan dengan alumina lainnya dan dapat menyebabkan reaksi polimerisasi, kondensasi dan dehidrasi (Gordon, 1972; Cannel, 1998). Penambahan oksidator (MnO2) pada fasa diam juga dapat

mengoksidasi senyawa alkohol menjadi aldehid. Ekstrak lipida dari ekstrak buah merah memerlukan komposisi MnO2 sebanyak 1,5% untuk dapat berubah menjadi

bentuk turunannya (Handayani, 2008). Sedangkan ekstrak β-karoten membutuhkan MnO2 sebanyak 5% untuk dapat berubah (Rumanthi, 2008).

Modifikasi yang telah dilakukan untuk ekstrak buah merah akan diperoleh senyawa turunan asam lemak yang berupa dioktil pthalat (Novianti,2010). Modifikasi yang dilakukan tanpa memisahkan senyawa awal dari komponen yang lain akan menurunkan produk dioktil pthalat yang dihasilkan. Apabila dilakukan modifikasi yang sama untuk buah kuning dimungkinkan akan terjadi reaksi yang sama dan dapat juga berbeda. Mengingat perbedaan kadar antara asam lemak dalam ekstrak buah kuning dengan ekstrak buah merah serta perbedaan kadar senyawa antioksidan yang dapat menghambat autoksidasi asam lemaknya.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user 2. Batasan Masalah

1. Sari buah kuning yang digunakan adalah sari buah kuning dari papua yang diproduksi oleh I Made Budi.

2. Teknik yang digunakan untuk memisahkan dan atau mereaksikan trigliserida didalam ekstrak buah kuning adalah teknik kromatografi kolom yang dimodifikasi fasa diamnya.

3. Fasa diam yang digunakan adalah campuran silika-alumina basa dengan perbandingan 2:3 dan penambahan MnO2 3% dan 5%.

3. Rumusan Masalah

1. Apakah dapat dilakukan pemisahan trigliserida dalam ekstrak buah kunig dengan menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom yaitu berupa penambahan alumina basa dan oksidator kedalam fasa diam silika gel, dengan memperhatikan pengaruh senyawa antioksidan dalam ekstrak tersebut.

2. Dengan memperhatikan perbedaan kadar antara asam lemak tak jenuh dan antioksidan dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah kuning apakah dalam fraksi trigliseridanya dapat dihasilkan senyawa turunan asam lemak (dioktil pthalat) seperti yang diperoleh dalam ekstrak buah merah.

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk memisahkan trigliserida dari ekstrak buah kuning menggunakan modifikasi kolom kromatografi dengan memperhatikan adanya pengaruh senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning serta perbedaan kadar antara asam lemak tak jenuh dan senyawa antioksidannya sehingga dapat diketahui pada ekstrak trigliserida kemungkinan dihasilkannya senyawa dioktil ptalat seperti pada ekstrak buah merah.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah memberikan informasi reaksi sekaligus pemisahan trigliserida dari ekstrak buah kuning menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom dengan memperhatikan pengaruh dari adanya suatu antioksidan dan perbedaan kadar asam lemak tak jenuh serta senyawa antioksidan di dalam ekstrak buah kuning dan ekstrak buah merah.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka 1. Buah Kuning

Buah kuning (Pandanus conoideus Lamk.) termasuk dalam famili Pandanaceae dengan varian kuning. Didaerah asalnya Papua, tanaman ini dikenal dengan nama sait, mongka memyeri, atau barkum. Buah ini tersebar hampir di seluruh wilayah Bumi Cendrawasih terutama di Pegunungan Arfak. Buah kuning berwarna kuning muda. Ukurannya mencapai panjang 102 cm, diameter 20 cm dan bobot 4 – 7,5 kg. Buah dibungkus dengan daun memanjang, pohonnya menjulang setinggi 16 – 17 m, ditopang akar – akar tunjang berdiameter 6 – 7 cm sepanjang 2,5 – 3,7 m. daun berwarna hijau tua, lanset dan ujung meruncing. Panjang daun 88 – 102 cm dan lebar 6 – 10 cm. seluruh tepi daun ditumbuhi duri sepanjang 1 mm ( Mangan, 2005 ).

Gambar 1. Buah kuning

Bagi masyarakat Wamena, buah kuning digunakan untuk pesta adat, namun banyak pula yang memanfaatkannya sebagai obat. Khasiat buah merah dan buah kuning yang sudah dikonsumsi turun-temurun di Papua dipercaya mampu menyembuhkan berbagai penyakit seperti penyakit mata, kulit, kanker rahim dan kanker paru-paru serta kanker hati (Moeljopawiro, 2007).

β-Karoten dalam buah kuning berfungsi memperlambat berlangsungnya penumpukan flek pada arteri. Interaksinya dengan protein meningkatkan produksi antibodi. Ini meningkatkan jumlah sel pembunuh alami yang dapat menekan kehadiran sel-sel kanker dan menangkal radikal bebas senyawa karsinogen

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

penyebab kanker. Konsumsi β-karoten rutin membuat tubuh dapat memperbanyak sel-sel alami pembasmi penyakit. Bertambahnya sel-sel tersebut akan menekan kehadiran sel kanker dengan menetralisir radikal bebas senyawa karsinogen penyebab kanker. Tokoferol (vitamin E) berfungsi hampir sama dengan β-karoten yaitu pencegah penyakit degeneratif. Tokoferol akan mematikan serbuan radikal bebas dan menetralisir kolesterol dalam darah (Dermawan, 2005; Duryatmo, 2005; Sofia, 2005).

2. Komponen-Komponen pada Ekstrak Buah Kuning

Komponen penyusun buah kuning terdiri dari trigliserida dan non trigliserida. Asam-asam lemak penyusun trigliserida terdiri dari asam lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh. Asam lemak merupakan asam organik berantai panjang yang mempunyai atom karbon dari (C4:0) sampai (C20:0). Asam lemak mempunyai gugus karboksil tunggal dan ekor hidrokarbon non polar yang panjang, yang menyebabkan kebanyakan lipid bersifat tidak larut didalam air (Lehninger, 1990). Asam lemak jenuh adalah asam lemak dengan rantai karbon yang tidak mengandung ikatan rangkap, sedangkan asam lemak tidak jenuh adalah asam lemak yang mengandung satu atau lebih ikatan rangkap (Poedjiadi, 1994). Beberapa contoh asam lemak disajikan dalam tabel 1.

Keberadaan ikatan ganda pada asam lemak tak jenuh menjadikannya memiliki dua bentuk: cis dan trans. Semua asam lemak nabati alami hanya memiliki bentuk cis (dilambangkan dengan "Z"). Asam lemak bentuk trans (trans fatty acid, dilambangkan dengan "E") hanya diproduksi oleh sisa metabolisme hewan atau dibuat secara sintetis. Akibat polarisasi atom H, asam lemak cis memiliki rantai yang melengkung. Asam lemak trans karena atom H-nya berseberangan tidak mengalami efek polarisasi yang kuat dan rantainya tetap relatif lurus.

Warna minyak disebabkan oleh adanya pigmen, karena asam lemak dan gliseridanya tidak berwarna. Warna orange dan kuning disebabkan adanya pigmen karoten yang larut dalam minyak tersebut. Apabila minyak dihidrogenasi, maka akan terjadi pula hidrogenasi pigmen yang dikandungnya, akibatnya terjadi

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

pengurangan warna pada minyak. Karoten tidak stabil pada suhu tinggi dan bila minyak diolah dengan menggunakan uap panas, maka karoten akan kehilangan warnanya (Ketaren, 1986).

Tabel 1. Beberapa Asam Lemak yang Umum

Nama Rumus

Asam Lemak Jenuh Butirat Kaproat Kaprilat Kaprat Laurat Miristat Palmitat Stearat Arakidat Behenat Lignoserat

CH3(CH2)2COOH

CH3(CH2)4COOH

CH3(CH2)6COOH

CH3(CH2)8COOH

CH3(CH2)10COOH

CH3(CH2)12COOH

CH3(CH2)14COOH

CH3(CH2)16COOH

CH3(CH2)18COOH

CH3(CH2)20COOH

CH3(CH2)22COOH

Asam Lemak Tak Jenuh Palmitoleat Oleat Petroselinat Linoleat Linolenat Elaeostrearat Arakidonat Erusat

CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH

CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH

CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4COOH

CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH

CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH

CH3(CH2)3CH=CHCH=CHCH=CH(CH2)7COOH

CH3(CH2)4CH=(CHCH2CH)3=CH(CH2)3COOH

CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH

a. Komponen Trigliserida (1). Trigliserida

Trigliserida adalah triester dari gliserol dengan asam-asam lemak, yaitu asam-asam karboksilat beratom karbon 6 s/d 30. Trigliserida banyak dikandung dalam minyak dan lemak, merupakan komponen terbesar penyusun ekstrak buah kuning. Selain trigliserida, terdapat juga monogliserida dan digliserida. Struktur molekul dari ketiga macam gliserid tersebut dapat dilihat pada Gambar 1. (Puspasari, 2007).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user R O OH O OH R O OH O O O R O O R3 R1 O O O O R2

monogliserida digliserida trigliserida

Gambar 2. Struktur molekul monogliserida, digliserida, dan trigliserida R1, R2, dan R3 merupakan rantai hidrokarbon yang berupa asam lemak dengan

jumlah atom C lebih besar dari sepuluh. Senyawa inilah yang akan dikonversi menjadi ester melalui reaksi transesterifikasi.

Trigliserida yang pada suhu kamar berupa zat padat disebut lemak, sedangkan trigliserida yang berupa cairan disebut minyak. Secara kimia, lemak sebagian besar terdiri atas asam lemak jenuh dan minyak mengandung lebih banyak asam tidak jenuh (Robinson, 1991). Oleh karena itu, molekul trigliserida bila terkondensasi hasilnya adalah satu molekul gliserol dan tiga asam lemak dengan melepaskan tiga molekul air.

H2C – OH HOOCR1 H2COOCR1

│ │

HC – OH + HOOCR2 HCOOCR2 + 3H2O

│ │

H2C – OH HOOCR3 H2COOCR3

Gliserol Asam Lemak Trigliserida Air Gambar 3. Reaksi kondensasi asam lemak

Trigliserida yang terkandung dalam minyak merupakan campuran berbagai macam asam lemak dan kecil kemungkinan yang sejenis (Astuti, 2002). Proses hidrolisis yang dilakukan biasanya dengan penambahan sejumlah basa yang dikenal dengan reaksi penyabunan atau saponifikasi. Selain dalam bentuk trigliserida asam lemak dalam ekstrak buah kuning juga terdapat dalam bentuk asam lemak bebas.

(2). Asam lemak bebas

Asam lemak bebas adalah asam lemak yang terpisahkan dari trigliserida, digliserida, monogliserida, dan gliserin bebas. Hal ini dapat disebabkan oleh pemanasan dan terdapatnya air sehingga terjadi proses hidrolisis. Oksidasi juga 9

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

dapat meningkatkan kadar asam lemak bebas dalam minyak nabati. HC – (CH2)7 – COOH

║

HC – (CH2)7 – CH3

Gambar 4. Contoh struktur asam lemak bebas (asam oleat) Tabel 2. Komposisi asam lemak dari minyak buah kuning

Jenis asam lemak Kandungan asam lemak % b/v

Asam myristat 0,055

Asam pentadekanoat 0,182

Asam palmitat 10,083

Asam stearat 3,154

Asam palmitoleat 1,377

Asam oleat 49,83

Asam linolenat 0,504

Asam linoleat 6,307

Asam eikosanoat 0,159

Asam behenat 0,852

(Budi,2004)

(3). Oksidasi asam lemak

Proses oksidasi dapat berlangsung jika terjadi kontak antara sejumlah oksigen dengan minyak atau lemak, umumnya yang berupa asam lemak tak jenuh. Mekanisme oksidasi lipida terjadi dari beberapa tahap. Menurut Meyes (1997) dan Hamilton (1983), autooksidasi lipida berjalan dengan dua tahap. Selama tahap pertama, oksidasi berjalan lambat dengan laju kecepatan seragam. Tahap pertama ini sering disebut periode induksi. Oksidasi pada periode induksi ini berlangsung beberapa waktu sampai pada waktu titik tertentu dimana reaksi memasuki tahap kedua yang mempunyai laju oksidasi dipercepat. Laju pada oksidasi tahap kedua beberapa kali lebih cepat dari laju oksidasi tahap pertama. Asam lemak yang memiliki ikatan rangkap lebih banyak (misal asam linoleat) bereaksi lebih cepat dibanding yang berikatan rangkap lebih sedikit (metil oleat) sehingga periode induksinya lebih pendek.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

R1 C C C R2

H

H

H H H

H

Asam lemak tidak jenuh

Energi (panas + sinar)

R1 C C C R2

H H H H

H

Radikal bebas

+ O₂

R₁ C C C R₂

H

O

H H H

H O

Peroksida aktif

R1 C C C R2

H

H

H H H

H

+

R1 C C C R2

H

O

H H H

H OH

+ R₁ C C C R₁

H H H H

H

Hidroperoksida

Radikal bebas

Gambar 5. Mekanisme oksidasi asam lemak pada tahap inisiasi dan propagasi Mekanisme oksidasi lipida tidak jenuh diawali dengan tahap inisiasi, yaitu berbentuknya radikal bebas (R*) bila lipida kontak dengan panas, cahaya, ion metal dan oksigen. Reaksi ini terjadi pada group metilen yang berdekatan dengan ikatan rangkap –C=C- (Buck, 1991). Ditambahkan oleh Gordon (1990), tahap inisiasi terjadi karena bantuan sumber energi ekstenal seperti panas, cahaya atau energi tinggi dari radiasi, inisiasi kimia dengan terlarutnya ion logam atau metaprotein seperti haem. Tahap selanjutnya adalah tahap propagasi dimana autooksidasi berawal ketika radikal lipida (R*) hasil tahap inisiasi bertemu dengan oksigen membentuk radikal peroksida (ROO*). Reaksi oksigenasi ini terjadi sangat cepat dengan energi aktivitas hampir nol sehingga konsentrasi ROO* yang terbentuk jauh lebih besar dari konsentrasi R* dalam sistem makanan dimana oksigen berada (Gordon, 1990). Radikal peroksida yang terbentuk akan mengekstrak ion hidrogen dari lipida lain (R1H) membentuk

hidroperoksida (ROOH) dan molekul radikal lipida baru (R1*). Selanjutnya

reaksi autooksidasi ini akan berulang sehingga merupakan reaksi berantai. Tahap terakhir oksidasi lipida adalah tahap terminasi, dimana hidroperoksida yang

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

sangat tidak stabil terpecah menjadi senyawa organik berantai pendek seperti aldehid, keton, alkohol dan asam (Rusmono, 2000). Peranan biologi yang penting dari lipid adalah sebagai : (1) komponen struktur membran; (2) lapisan pelindung pada beberapa jasad; (3) bentuk energi cadangan; (4) komponen permukaan sel yang berperan dalam proses interaksi antara sel dengan senyawa kimia di luar sel, seperti dalam proses kekebalan jaringan; dan (5) sebagai komponen dalam proses pengangkutan melalui membran (Wirahadikusuma, 1985).

b. Komponen Non Trigliserida (1). Karotenoid

Karotenoid adalah suatu senyawa golongan terpena yang merupakan golongan pigmen yang larut dalam lipida dan tersebar luas, terdapat dalam semua jenis tumbuhan. Pada tumbuhan, karotenoid mempunyai dua fungsi, yaitu suatu pigmen pembantu dalam fotosintesis dan sebagai pewarna pada bunga dan buah. Dalam bunga, karotenoid kebanyakan berupa zat warna kuning sedangkan di dalam buah dapat juga berupa zat warna jingga atau merah (Harborne, J. B., 1996). Ada banyak jenis karotenoid yang telah banyak ditemukan. Hidrokarbon karotenoid seperti β-karoten dan lycopene, dikenal dengan karoten, sedangkan turunan teroksigenasinya disebut xanthophyl. Di alam, karotenoid stabil terdapat dalam bentuk all-trans (all-E), tetapi juga ada sejumlah kecil yang terdapat dalam bentuk cis (Z). Modifikasi atas kerangka karotenoid dasar, terjadi dan menghasilkan berbagai macam metabolit. Metabolit karotenoid yang paling penting adalah vitamin A (Richard B. Herbert, 1995). Di antara lebih dari 400 jenis karotenoid yang layak ditentukan sifat-sifatnya dengan baik, hanya sekitar 30 jenis yang mempunyai aktivitas sebagai provitamin A. Untuk manusia dan hewan-hewan percobaan, kelompok karotenoid yang aktif secara biologis, secara tidak seragam mengandung paling sedikit satu cincin β-ionon yang tidak tersubstitusi. Karotenoid yang paling aktif adalah all-transβ-karoten.

β-Karoten adalah salah satu jenis senyawa hidrokarbon karotenoid yang merupakan senyawa golongan tetraterpenoid (Winarsi, 2007). Adanya ikatan ganda menyebabkan β-karoten peka terhadap oksidasi. Oksidasi β-karoten akan lebih cepat dengan adanya sinar, dan katalis logam, khususnya tembaga, besi dan 12

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

mangan. Oksidasi akan terjadi secara acak pada rantai karbon yang mengandung ikatan rangkap. β-karoten merupakan penangkap oksigen dan sebagai antioksidan yang potensial, tetapi β-karoten efektif sebagai pengikat radikal bebas bila hanya tersedia oksigen 2 – 20 %. Pada tekanan oksigen tinggi diatas kisaran fisiologis, karoten dapat bersifat pro-oksidan (Burton, 1989).

β-Karoten mengandung ikatan rangkap terkonjugasi yang memberikan karakter pro-oksidan, akibatnya akan sangat mudah diserang melalui penambahan radikal peroksil.

β-caroten + ROO* β-car* β-car* + O2 β-car-OO*

β-car* + ROO* produk tak aktif

Radikal β-karoten (β-car*) yang terbentuk bereaksi dengan cepat dan reversible dengan oksigen untuk membentuk radikal peroksil yang baru (β-car-OO*).

Reaktivitas β-karoten menjadi radikal peroksil dan stabilitas pembentukan β-car* adalah dua gambaran penting yang memberikan molekul tersebut kemampuan antioksidan. Reaktivitas β-karoten artinya senyawa tersebut mempunyai potensi untuk menyerang radikal peroksil yang diturunkan dari molekul lipida yang lain, walaupun ketika berada pada konsentrasi rendah. Stabilitas β-car* artinya adalah pada tekanan O2 yang rendah, bentuk tersebut

dapat mendominasi seluruh bentuk radikal peroksil. Radikal β-car* dapat dilepaskan dari sistem reaksi dengan radikal peroksil yang lain (Burton, 1988).

β-Karoten memiliki 11 ikatan rangkap karbon-karbon yang terkonjugasi. Zat ini merupakan prekursor biologis bagi vitamin A, yaitu alkohol tak jenuh berkarbon 20, yang juga disebut retinol. Retinol ini menghasilkan 11-cis-retinal (Gambar 5). Konversi vitamin A menjadi 11-cis-retinal tidak hanya melibatkan oksidasi gugus alkohol menjadi aldehid, tetapi juga isomerisasi trans menjadi cis pada ikatan rangkap C11 – C12 (Hart, 2003). Dalam tubuh, satu molekul β-karoten

akan diubah menjadi dua molekul retinil dan dipecah dalam mukosa dari usus kecil oleh β-karoten- dioksigenase menjadi retinol, sebuah bentuk dari vitamin A. Retinol dioksidasi menjadi retinaldehid dan sebagian kecil aldehid ini diubah menjadi asam retinoat yang juga merupakan salah satu bentuk vitamin A. 13

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

Penjelasan tersebut menunjukkan bahwa β-karoten dalam tubuh dapat diubah menjadi vitamin A melalui reaksi oksidasi enzimatis. Namun, penelitian Lederrer (1957) menunjukkan bahwa vitamin A dapat dioksidasi menjadi retinen (salah satu bentuk vitamin A) menggunakan teknik kromatografi dengan penambahan MnO2 pada fasa diamnya.

Vitamin A secara umum relatif lebih stabil dalam panas, asam dan basa bila dibandingkan dengan β-karoten, namun vitamin A juga mudah teroksidasi atau rusak dengan udara, pemanasan suhu tinggi, terkena sinar atau bila berada dalam lemak yang sudah tengik. Karotenoid berperan penting dalam kesehatan manusia yaitu bertindak sebagai antioksidan biologi, melindungi sel dan jaringan dari pengaruh radikal bebas dan oksigen tunggal. Kegunaan karotenoid yang lain adalah berhubungan dengan potensial oksidatif fungsi sistem imun atau ketahanan tubuh dan penghambatan perkembangan kanker.

Beta-karoten ↓ [O]

CH2OH

Vitamin A (retinol) ↓Enzim

O H

11-cis-retinal

Gambar 6. Konversi β-karoten

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user (b). Tokoferol

Tokoferol merupakan senyawa kimia yang mempunyai aktivitas vitamin E. Tokoferol dalam minyak dapat berfungsi sebagai antioksidan sehingga minyak dan karoten yang terkandung didalamnya dapat terlindungi dari oksidasi. Sebagai antioksidan tokoferol berfungsi sebagai donor hidrogen yang mampu mengubah radikal peroksil menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif, sehingga mampu merusak rantai asam lemak (Winarsi, 2007). Tokoferol relatif stabil terhadap suhu tinggi, namun sensitif terhadap oksidasi (Winarno, 1991). Ada dua mekanisme berbeda untuk menunjukkan kerja vitamin E sebagai antioksidan yaitu (1) vitamin E bereaksi langsung dengan oksigen dan (2) vitamin E bekerja untuk menangkap radikal turunan asam lemak tidak jenuh dan menghentikan auto-oksidasi (Giamalva, 1985). α-Tokoferol (Gambar 6) mempunyai kecenderungan menjadi pro-oksidan pada dosis tinggi dan menyebabkan tekanan oksidatif yang dapat memodulasi sinyal transduksi, mengalihkan gen dan mempengaruhi respon sel seperti perkembangbiakan, diferensiasi dan reproduksi. Untuk itu, α-tokoferol harus digunakan secara hati-hati (Gulcin, 2005).

O CH3

HO

H3C

CH3

CH3

H CH3 H CH3

CH3

CH3

Gambar 7. Struktur α-Tokoferol

c. Aktivitas Antioksidan (1). Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan sekelompok zat kimia yang sangat reaktif karena memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Radikal bebas adalah oksidan, tetapi tidak semua oksidan merupakan radikal bebas. Oksidan merupakan senyawa yang dapat menerima elektron dan radikal bebas merupakan atom atau gugus yang orbital luarnya memiliki elektron yang tidak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1994). Senyawa oksigen reaktif

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

(Reactive Oxygen Species = ROS) diproduksi secara terus menerus di dalam tubuh manusia sebagai akibat proses metabolisme normal (Langseth, 1995).

Selama makanan dioksidasi untuk menghasilkan energi, sejumlah radikal bebas juga terbentuk. Radikal bebas berfungsi untuk memberikan perlindungan tubuh terhadap serangan bakteri dan parasit. Namun tidak menyerang sasaran spesifik, sehingga akan menyerang asam lemak tidak jenuh ganda dari membran sel, struktur sel, dan DNA. Radikal bebas adalah oksidan, tetapi tidak semua oksidan merupakan radikal bebas. Oksidan merupakan senyawa yang dapat menerima elektron dan radikal bebas merupakan atom atau gugus yang orbital luarnya memiliki elektron yang tidak berpasangan. Radikal bebas dan senyawa oksigen reaktif yang diproduksi dalam jumlah yang normal, penting untuk fungsi biologi (Haryatmi, 2004).

Beberapa hipotesis menjelaskan tentang radikal bebas pada diabetes mellitus, seperti glikosilasi protein non enzimatik, autooksidasi glukosa gangguan metabolisme glutation, perubahan enzim antioksidan dan pembentukan lipid peroksidasi. Peningkatan radikal bebas secara umum menyebabkan gangguan fungsi sel dan kerusakan oksidatif pada membran. Pada kondisi tertentu antioksidan mempertahankan sistem perlindungan tubuh melalui efek penghambat pembentukan radikal bebas. Efisiensi mekanisme pertahanan tersebut mengalami perubahan pada diabetes mellitus. Penangkapan radikal bebas yang tidak efektif dapat menyebabkan kerusakan jaringan (Rajasekaran et al., 2005 ; Kaleem et al., 2006). Radikal bebas bereaksi dengan biomembran menyebabkan destruksi oksidatif asam lemak tak jenuh membentuk aldehid sitotoksik melalui peroksidasi lipid. Selanjutnya peroksidasi lipid diukur dengan thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) dan lipid hydroperoxides (HPX) yang merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid. Peningkatan peroksidasi lipid pada membran dan lipoprotein terjadi pada diabetes. HPX yang terbentuk dari peroksidasi lipid memiliki efek toksik langsung pada sel endothelium dan juga terdegradasi membentuk radikal hidroksil (OH*). Hal tersebut dapat terlihat pada sel β pankreas (Pari dan Latha , 2005).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user (2). Antioksidan

Suatu senyawa dikatakan memiliki sifat antioksidan bila senyawa tersebut mampu mendonasikan satu atau lebih elektron kepada senyawa perooksidan, kemudian mengubah senyawa oksidan menjadi senyawa yang lebih stabil. Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dapat dikelompokkan menjadi tiga kelompok, yaitu:

(a). Antioksidan primer(antioksidan endogen atau antioksidan enzimatis), contohnya enzim peroksidase dismutase, katalase dan glutation peroksidase. Enzim-enzim ini mampu menekan atau menghambat pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk stabil. Reaksi ini disebut sebagi chain-breaking-antioxidant.

(b). Antioksidan sekunder (antioksidan eksogen atau antioksidan non enzimatis). Contoh antioksidan sekunder ialah vitamin E, vitamin C, β-karoten, isoflavon, asam urat, bilirubin dan albumin. Senyawa-senyawa ini dikenal sebagai penangkap radikal bebas (scavenger free radical), kemudian mencegah amplifikasi radikal.

(c). Antioksidan tersier, misalnya enzim DNA-repair, metionin sulfoksida reduktase, yang berperan dalam perbaikan biomolekul yang disebabkan oleh radikal bebas (Winarsi, 2005).

Penambahan antioksidan (AH) dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi auto-oksidasi. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap insiasi dan propagasi dengan memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) dan mengubahnya menjadi bentuk lebih stabil.

Tahap inisiasi: R* + AH → RH + A*

Tahap propagasi: ROO* + AH → ROOH + A*

Sementara itu, turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan yang lebih stabil dibanding radikal lipida dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal baru (Schultz, 1962, deMan, 1997).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

Pada penghambatan oksidasi lipida, salah satu masalah yang menarik adalah mekanisme dimana antioksidan menstabilkan vitamin A dan karoten. Struktur oksida terjadi melalui ikatan oksigen pada bagian tak jenuh dari cincin. Namun hal ini tidak terjadi pada rantai. Antioksidan fenolik menghambat oksidasi tersebut. Aktivitas vitamin A sebagai antioksidan diperkuat dengan menggunakan antioksidan fenolik (Schultz, 1962; Paiva, 1999).

3. Kromatografi

Kromatografi mencakup berbagai proses berdasarkan perbedaan distribusi antara dua fasa dari penyusun cuplikan. Satu fasa tetap tinggal dalam sistem dan dinamakan fasa diam, sedangkan fasa yang lain dinamakan fasa gerak untuk memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. (Sudjadi, 1988). Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengubah langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat adalah kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penyerapan) dan kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) (Gritter, Bobbitt, 1991).

Jika fasa gerak digerakkan melalui fasa diam untuk menghasilkan pemisahan kromatografi, proses ini dikenal sebagai pengembangan. Pengembangan ialah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Setelah senyawa-senyawa dipisahkan dengan pengembangan, hasilnya dideteksi (divisualisasi atau ditampakkan). Jika senyawa-senyawa yang dipisahkan benar-benar dikeluarkan dari sistem, maka senyawa itu telah dielusi. Senyawa yang telah dipisahkan disebut solut atau cuplikan (Gritter, 1991).

a. Kromatografi kolom

Kromatografi kolom merupakan kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar. Kromatografi kolom merupakan metode terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari satu gram). Kadang-kadang cara ini disebut dengan kromatografi cair preparatif. Penggunaan kromatografi kolom 18

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

adalah untuk mendapatkan hasil zat murni secara preparatif dari campuran dan untuk pemisahan zat pada penentuan kuantitatif maupun kualitatif. Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau tabung plastik. Pelarut dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Walaupun banyak jenis penyerap telah dipakai untuk kolom, silika gel dan alumina merupakan penyerap paling banyak digunakan. (Gritter, 1991).

Tabel 3. Urutan kepolaran eluen, elusi senyawa, dan kekuatan adsorben dalam kromatografi Urutan Polaritas Eluen Urutan Elusi Senyawa Urutan Adsorben Petroleum eter Karbon tetraklorida Benzene Kloroform Dietil eter Etil asetat Aseton Etanol Methanol Air

Hidrokarbon tak jenuh Alkena

Hidrokarbon aromatik Eter

Aldehida, keton, ester Alkohol

Asam karboksilat

Selulosa Gula

Asam silika (silika gel) Florisil (magnesium silikat) Aluminium oksida (alumina)

Beberapa kombinasi heksana atau petroleum eter (40 – 60 oC, bp) dan dietil eter, biasanya dengan asam asetat (90:10:1) atau diisopropil eter dan asam asetat (98,5:1,5) umumnya digunakan untuk pemisahan lipida non polar. Mobilitas terbesar ditunjukkan oleh ester kolesterol diikuti oleh triasilgliserol, asam lemak bebas, kolesterol, diasilgliserol, monoasilgliserol (Holme, 1993).

b. Alumina

Alumina (Al2O3) adalah salah satu adsorben yang digunakan pada

kromatografi. Penyerap ini seringkali dipakai untuk pemisahan alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-vitamin, karoten dan asam-asam amino. (Sastrohamidjoyo, 2002). Alumina yang diperoleh dari perdagangan dengan bersifat asam netral atau basa. Alumina, terutama bila bersifat alkali, sering menyebabkan perubahan kimia dan menimbulkan reaksi-reaksi. Sebagai misal, ia 19

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

dapat menyebabkan kondensasi dari aldehid-aldehid dan keton-keton, hingga bila hal ini terjadi dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai senyawa seperti terpen dan sterol. (Sastrohamidjoyo, 2002). Hal ini dapat dicegah dengan mencucinya dengan larutan asam atau dengan air (terakhir diikuti dengan metanol), kemudian direaktivasi pada suhu 200˚C. Pemanasan alumina diatas suhu 500˚C sebaiknya dihindari; Lederer (1957) menyatakan bahwa permukaan alumina teatap konstan hingga suhu 528˚C, kemudian menurun sampai 15% pada suhu 734˚C dan menurun 40% setelah pemanasan pada suhu 938˚C. Satu gram alumina untuk kromatografi mempunyai luas permukaan sebesar 90m2_{, darinya}

hanya sebesar 6m2 _{per gram yang tidak berguna sebagai adsorben.}

Ald+ _Ald+

O d-O

d-O d-O

d-O

Ald+

O

d-O O

Gambar 8. Struktur alumina

Alumina yang digunakan untuk kromatografi berbentuk serbuk putih. Ukuran partikel alumina berkisar 50 – 200 µm (70 – 290 mesh). Alumina dapat dihasilkan dengan permukaan asam, basa, dan netral, berdasarkan pH dari adsorben. Alumina asam mempunyai pH mendekati 4 dan paling berguna untuk pemisahan senyawa asam seperti asam karboksilat. Alumina asam dapat menyebabkan dehidrasi alkohol (terutama alkohol tersier). Alumina basa (pH mendekati 10) berguna untuk pemisahan senyawa basa seperti alkaloid. Alumina basa dapat menyebabkan hidrolisis ester. Alumina juga dapat menyebabkan hidrolisis dari lipida alkalilabile (Renkonsen, 1961). Alumina netral (pH mendekati 7) sering digunakan untuk pemisahan senyawa non polar seperti steroid (Cannel, 1998; Gordon, 1972).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user O

Al3+

Al3+ Cl

Cl

O

Al3+ Al3+ O

Al3+ O

Al3+ O

O Na

Na

(a) (b) (c)

Gambar 9. Struktur Dasar Alumina (a) Asam, (b) Netral, (c) Basa

Alumina dapat bertindak sebagai katalis superbasa dan menyebabkan isomerisasi ikatan rangkap pada olefin. Logam Na akan terionisasi dan elektron yang terlepas akan berpindah ke atom oksigen. Atom oksigen dengan muatan negatif yang lebih tinggi akan menghasilkan kemampuan donor elektron yang kuat. Atom oksigen memiliki jumlah elektron yang lebih banyak akan mempunyai kemampuan donor elektron yang lebih tinggi dan mempunyai kebasaan yang tinggi pula (Widodo, 2002). Alumina bila digunakan dengan eluen organic akan menyerap aromatik dan hidrokarbon tidak jenuh, karotenoid, steroid, alkaloid dan produk alam lainnya. Alumina dapat mengkatalisis reaksi inter maupun intramolekular, terutama senyawa yang sensitif terhadap basa seperti alkali (Bratihwaite and Smith, 1995). Pemisahan beberapa lipida menggunakan kolom alumina menghasilkan peningkatan kemampuan adsorbsi dimulai dari hidrokarbon, ester kolesterol, trigliserida, kolesterol bebas, asam lemak dan fosfatida (Holme, 1993).

c. Silika Gel

Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Penyerap ini seringkali digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa asam-asam aminio, alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, minyak esensial, anion dan kation organik, sterol dan terpenoid. Silika gel yang digunakan kebanyakan kebanyakan diberi binder (pengikat) yang dimaksudkan untuk memberikan kekuatan pada lapisan, dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang banyak digunakan adalah kalsium sulfat. Tetapi, dalam perdagangan biasanya silika gel 21

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

telah diberi pengikat dengan kode silika gel G (Sastrohamidjoyo, 2002).

Silika merupakan adsorben yang bersifat polar. Adsorben polar ini berinteraksi dengan molekul yang akan diadsorb melalui beberapa gaya, antara lain dengan tarikan elektrostatik dan ikatan hidrogen. Silika merupakan asam lemah karena adanya grup Si-OH, sedangkan alumina merupakan adsorben polar yang bersifat basa kuat karena keberadaan O2-_{. Adsorben asam akan lebih}

menahan komponen basa untuk menaikkan kebasaannya, demikian juga pada pada adsorben basa akan cenderung menahan komponen asam. Penanganan silika gel yang diperoleh secara komersial, biasanya diaktifkan dengan pemanasan pada suhu 100˚C selama 24 jam kemudian mengerikannya dalam desikator selama 24 jam (Lederer, 1957).

Si O O O

H

Si O O

O H

O

Si O O

O H

Gambar 10. Struktur Silika Gel

4. Mangan Dioksida (MnO2)

Oksidasi benzil dan alil alkohol menjadi aldehid dan keton dapat dilakukan dengan menggunakan padatan mangan dioksida, MnO2. Kekuatan

oksidasi reagen ini tergantung pada ukuran partikel dan derajad hidrasinya. Reaksi oksidasi terjadi pada permukaan oksida dan mengakibatkan pembentukan radikal sebagai intermediet. Produk samping dari reaksi ini adalah manganese (MnO). Solven seperti petroleum eter, aseton, dan metilen klorida, dimana oksida tidak dapat larut, digunakan dalam oksidasi. Pentingnya menggunakan solven karena reaksi terjadi melalui koordinasi substrat dan reagen. Solven dapat mempengaruhi derajad adsorpsi dan desorpsi alkohol pada mangan dioksida. Jika alkohol primer atau sekunder digunakan sebagai solven, kompetisi adsorpsi situs alkohol akan mengurangi hasil produk oksidasi.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

Alkohol jenuh juga teroksidasi oleh MnO2, tetapi dengan kecepatan yang

lebih lambat dibandingkan dengan benzil atau alil alkohol. Hal ini menjadikan reagen MnO2 kemoselektif untuk jenis alkohol ini. Benzil dan alil alkohol primer

diubah menjadi aldehid sedangkan bentuk sekundernya menjadi keton.

C C

H

H CH2OH

C C

H

H CHO

trans-cinamil alkohol _{trans-cinamaldehid}

MnO2

petroleum eter

Gambar 11. Pengubahan vitamin A menjadi retinal oleh MnO2

Mangan dioksida dapat digunakan untuk mengubah vitamin A menjadi retinal dengan menggunakan petroleum eter sebagai solven (Palleros, 2000; Smith, 1946).

B. Kerangka Pemikiran

Buah kuning merupakan sub spesies dari buah merah, Ekstrak buah kuning mengandung senyawa-senyawa diantaranya adalah asam lemak yang berada dalam bentuk trigliserida dan senyawa antioksidan seperti β-karoten dan tokoferol. Trigliserida dalam ekstrak akan dipisahkan dengan menggunakan teknik modifikasi fasa diam kromatografi kolom.

Berdasarkan penelitian sebelumnya kandungan asam lemak dan β-karoten dalam buah merah dapat dipisahkan dan dioksidasi dengan menggunakan metode kromatografi yang dimodifikasi fase diamnya dengan penambahan alumina dan MnO₂ pada silika gel. Adanya perbedaan warna yang dimiliki oleh buah kuning

dimungkinkan akan terjadi reaksi yang sama karena kandungan asam lemak dan senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning hampir seluruhnya sama dengan ekstrak buah merah, hanya berbeda dalam kadarnya.

Alumina dapat menyebabkan reaksi saponifikasi gliserida dan auto-oksidasi asam lemak serta hidrolisis ester. Alumina juga dapat bertindak sebagai katalis basa yang dapat menyebabkan isomerisasi pada ikatan rangkap. Sedangkan MnO2 dapat mengoksidasi benzil dan alil alkohol menjadi bentuk aldehid dan

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

keton. Alumina dan silika gel dapat memisahkan lipida menjadi kelas-kelasnya dimulai dari trigliserida, asam lemak bebas, digliserida dan monogliserida.

Asam lemak tak jenuh dalam trigliserida dapat mengalami oksidasi yang diawali dengan terbentuknya radikal bebas dengan oksigen sehingga menghasilkan glikol dan hasil pemenggalan seperti aldehid dan asam karboksilat berantai pendek. β-karoten dengan aktivitas vitamin A yang besar dapat dioksidasi menjadi retinen dengan menggunakan teknik kromatografi yang fasa diamnya diberi MnO2. β-karoten juga dapat bertindak sebagai antioksidan yang dapat

mencegah terjadinya oksidasi lipida.

Mekanisme yang mungkin terjadi adalah trigliserida, β-karoten dan tokoferol terpisah bersama-sama. Selama elusi, ketiga senyawa tersebut bertemu dengan oksidator. β-karoten dan tokoferol yang mempunyai fungsi sebagai antioksidan akan menghalangi trigliserida yang mempunyai asam lemak dengan ikatan rangkap untuk mengalami reaksi oksidasi. Sehingga selama pemisahan, trigliserida akan terlindungi dari oksidator dan dapat dipisahkan dari ekstrak buah kuning tanpa merusak trigliserida tersebut.

C. Hipotesis

Berdasarkan uraian diatas dapat diambil hipotesis yaitu trigliserida dapat dipisahkan dari ekstrak buah kuning menggunakan teknik kromatografi yang dimodifikasi fasa diamnya (penambahan alumina basa dan oksidator kedalam silika gel). Namun dengan adanya pengaruh fasa diam modifikasi dan antioksidan dalam ekstrak, mengakibatkan terjadi suatu reaksi yang dapat menghambat oksidasi asam lemaknya.

Dengan adanya perbedaan daya tahan terhadap oksidasi karena perbedaan kadar antara asam lemak dan senyawa antioksidan dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah kuning dimungkinkan akan dihasilkan senyawa dioktil ptalat sebagai turunan asam lemak yang sama dengan ekstrak buah merah.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen di laboratorium kimia. Penelitian pendahuluan adalah penentuan perbandingan fasa gerak dan fasa diam untuk kromatografi kolom dengan metode KLT menggunakan plat modifikasi. Fasa diam berupa campuran silika-alumina(2:3) dengan penambahan MnO2 3% dan 5%. Setelah diperoleh data KLT dilakukan

pemisahan ekstrak buah kuning dengan kromatografi kolom menggunakan fasa diam campuran silika-alumina(2:3) dengan penambahan MnO2 3%. Ekstrak buah

kuning dielusikan pada kolom kromatografi menggunakan eluen campuran PE-dietil eter(1:1). Hasil pemisahan diidentifikasi dengan spektroskopi infra merah(IR), dan Gas Chromatography – Mass Spectroscopy (GC-MS).

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Sublab Kimia Laboratorium Pusat Universitas Sebelas Maret Surakarta. Sedangkan identifikasi dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.Waktu kegiatan penelitian berlangsung pada bulan Juli 2009 – April 2010.

C. Alat dan Bahan yang Digunakan 1. Alat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1. Kolom kromatografi tekan 2. Alat-alat gelas buatan pyrex 3. GC-MS QP2010S Shimadzu 4. IR Shimadzu FTIR Prestige 21

5. TLC Plate Coater

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

6. TLC Chamber

7. Oven

8. Syringe whatman 0,2 µm TF 9. Lampu UV

2. Bahan-bahan yang digunakan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1. Ekstrak buah kuning dari Papua Irian Jaya produksi I Made Budi 2. Silika Gel 60 GF254 for TLC (Merck)

3. Aluminiumoxid 150 aktiv basisch (Merck) 4. Silica gel 60, 70-230 Mesh ASTM(Merck)

5. Aluminiumoxid 60 aktiv basisch 70-230 Mesh ASTM (Merck) 6. PE teknis (Merck)

7. dietil eter p.a (Merck) 8. metanol p.a (Merck) 9. rodamin B(Merck) 10. MnO2(Merck)

D. Prosedur Penelitian 1. Clean up sampel

Sebanyak 1 g ekstrak buah kuning dilarutkan dalan 10ml dietil eter. Kemudian ekstrak diinjeksikan pada syring whatman dengan ukuran pori 0,2 µm. Ekstrak diuapkan untuk mendapatkan ekstrak pekat kembali. 2. pembuatan 0,5 % Rhodamin B dalam etanol

Sebanyak 0,4 g rhodamin B dilarutkan dalam 100ml etanol. 3. Kromatografi Lapis Tipis

KLT awal adalah KLT silika pabrik untuk identifikasi awal dari ekstrak buah kuning dan untuk penentuan eluen. Ekstrak buah kuning dielusikan pada plat KLT dengan cara ditotolkan dengan mikropipet. Dan dimasukkan dalam gelas piala yang berisi eluen campuran PE dan dietil eter dengan perbandingan (19:1; 9:1; 7:3; 5:5) sebagai larutan pengembang kemudian dibiarkan terelusi/mengembang. Plat kemudian disemprot 26

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

dengan larutan rhodamin B yang akan memberikan bercak merah muda pada plat di bawah sinar UV.

KLT selanjutnya menggunakan plat yang telah dimodifikasi. Silika gel dipanaskan pada 120o_{C dan alumina dipanaskan pada 150}o_{C selama}

satu jam. Untuk plat dibuat bubur silika gel-alumina ditambahkan MnO2

3% dan 5%. Masing-masing bubur adsorben kemudian diratakan pada plat KLT dan dikeringkan diudara. KLT dilakukan untuk penentuan banyaknya fraksi buah kuning pada kromatografi kolom. Ekstrak buah kuning ditotolkan pada plat KLT. Kemudian plat dielusikan dengan eluen campuran PE:dietil eter(1:1).

4. kromatografi kolom flash

1 g Ekstrak buah kuning dielusi dalam kolom kromatografi dengan fasa diam silika-alumina(3:2) dengan penambahan MnO2 3%. Eluen yang

digunakan PE-dietil eter dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3. Eluat yang dihasilkan kemudian ditampung dalam vial-vial tiap 3 mL dan dikeringkan dari pelarutnya.

Eluat yang telah kering dari pelarut atau eluen kemudian ditimbang dan diuji dengan KLT. Nilai Rf yang dihasilkan dibandingkan dengan nilai Rf dari plat KLT silika gel awal. Nilai Rf yang sama dikumpulkan kemudian fraksi yang dihasilkan diidentifikasi dengan menggunakan IR dan GC-MS.

E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data a. Pengumpulan Data

Penentuan fasa diam dan eluen dengan menggunakan KLT akan diperoleh data berupa spot-spot hasil pemisahan untuk tiap perbandingan eluen petroleum eter dan dietil eter dan penambahan MnO2 dalam fasa diam, yang selanjutnya

hasil pemisahan yang baik akan digunakan dalam pemisahan kromatografi kolom. Pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi akan dihasilkan eluat. Tiap eluat diuji dengan KLT dan menghasilkan nilai Rf yang kemudian 27

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

dibandingkan dengan nilai Rf awal. Fraksi yang sama dikumpulkan dan kemudian dilakukan identifikasi.

b. Analisis Data a. Infrared Spectroscopy (IR)

Identifikasi dengan IR dilakukan untuk menentukan gugus fungsi dari senyawa-senyawa yang ada dalam fraksi.

b. Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS)

Identifikasi dengan GC-MS digunakan untuk memperkirakan senyawa-senyawa yang dihasilkan.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Persiapan Sampel

Ekstrak buah kuning yang digunakan dalam penelitian ini berupa cairan minyak berwarna cokelat kekuningan. Preparasi awal sampel adalah clean up ekstrak buah kuning menggunakan whatman TF dengan ukuran pori 0,2 µm. Filter ini dibuat dengan menggunakan membran PTFE (Politetrafluoroethylene) yang spesifik untuk pemisahan senyawa organik, filtrasi pelarut non air dan ideal digunakan pada analisis HPLC, TLC, dan GC. Metode yang digunakan untuk clean up adalah metode injeksi. Sebanyak 1 gram ekstrak buah dilarutkan dalam 10 ml dietil eter, ekstrak kemudian diinjeksikan pada syring hingga diperoleh ekstrak encer. Ekstrak dibiarkan agar pelarut menguap hingga diperoleh ekstrak pekat kembali.

Tujuan utama clean up adalah membersihkan pengotor dan matriks-matriks lain dalam ekstrak buah kuning yang dapat mengganggu pemisahan. Ekstrak awal berwarna cokelat kekuningan dan setelah dilakukan clen up diperoleh ekstrak berwarna kuning pekat. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak telah bersih dari pengotor dan matriks-matriks lain yang dapat menggangu pemisahan seperti senyawa tanin dan selulosa.

B. Penentuan Fasa Gerak dan Fasa Diam

Pemisahan trigliserida dalam ekstrak buah kuning diawali dengan penentuan komposisi fasa diam dan fasa gerak yang akan digunakan. Penentuan ini dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fasa gerak yang akan digunakan dalam kromatografi kolom ditentukan dengan menggunakan plat TLC silica gel 60 F254. Trigliserida dan β-karoten merupakan senyawa

non-polar yang saling bercampur satu sama lain. Kedua senyawa tersebut dapat larut dalam eluen petroleum eter dan dietil eter sehingga digunakan larutan pengembang PE dan dietil eter. Perbandingan larutan pengembang yang digunakan adalah 19:1, 9:1, 7:3, 1:1. Harga rf dari spot yang dihasilkan terlihat

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

pada tabel 4. Perbandingan yang digunakan adalah perbandingan fasa gerak yang memberikan spot terbanyak dengan harga rf yang tinggi.

Tabel 4. Harga Rf dari spot hasil pemisahan ekstrak buah kuning (gambar plat terlampir pada lampiran 2)

Fasa diam

Silika Gel Silika gel :

Alumina (2:3)

19:1* Warna 9:1* warna 7:3* warna 1:1* warna 1:1* Warna

0,53 kuning **

0,58 kuning **

0,68 kuning **

0,8 kuning

**

0,8 kuning

**

- - - 0,2 Tak

berwar na * Perbandingan eluen PE:Dietil eter

** lama-kelamaan menjadi pudar kemungkinan karena β-karoten teroksidasi

Hasil terbaik diperoleh pada perbandingan 1:1 dimana dihasilkan satu spot berwarna kuning dengan harga rf sebesar 0,8. Untuk perbandingan fasa gerak yang lebih non polar yaitu pada perbandingan 19:1 dan 9:1 dihasilkan spot yang tailing dan harga rf rendah, ketika kepolaran dinaikkan dihasilkan satu spot tunggal dengan harga rf yang relatif rendah sehingga perlu dinaikkan lagi kepolarannya hingga dihasilkan spot yang tidak tailing dan nilai rf tinggi. Adanya satu spot mengindikasikan bahwa ekstrak kurang dapat terpisah dengan fasa diam silika gel saja. Untuk hasil pemisahan yang lebih baik adalah dengan pencampuran fasa diam antara silika gel dengan alumina. Alumina merupakan adsorben kuat sehingga interaksinya mengikat solut juga lebih kuat dibanding silika. Hal ini mengakibatkan senyawa-senyawa dalam ekstrak buah kuning yang bersifat polar akan semakin tertahan didalam fasa diam sedangkan senyawa non polar akan terelusi lebih cepat. Alumina yang digunakan adalah alumina yang teraktifasi basa. Sifat basa pada alumina dapat menyebabkan reaksi saponifikasi pada trigliserida yang akan berpengaruh pada hasil pemisahan.

Penentuan perbandingan yang digunakan antara silika gel dengan alumina berdasarkan pada acuan penelitian sebelumnya bahwa asam lemak dan β-karoten dalam ekstrak buah merah terpisah terpisah baik pada perbandingan 2:3 30

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

(Handayani; Rumanthi, 2008). Diduga terjadi hal yang sama untuk pemisahan ekstrak buah kuning. Pada perbandingan ini dihasilkan 2 spot dengan harga rf pada tabel 4. Spot pertama berwarna kuning, namun agak memudar jika dibiarkan terlalu lama. Spot kedua tidak berwarna dan akan tampak apabila disemprot dengan rhodamin B dan dilihat menggunakan lampu UV. Rhodamin B adalah reagen yang digunakan untuk untuk menguji adanya trigliserida dan asam lemak (Jork,1990). Adanya spot kedua mengindikasikan bahwa asam lemak bebas pada ekstrak buah kuning telah terpisah dari trigliseridanya.

Kombinasi fasa diam antara silika dengan alumina untuk mendapatkan hasil pemisahan yang paling baik sedangkan untuk pengubahan senyawanya dilakukan dengan penambahan MnO2. MnO2 berfungsi sebagai oksidator yang

dapat mengoksidasi trigliserida. Komposisi MnO2 yang ditambahkan adalah 3%

dan 5%. Asam lemak dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO2 dan

terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO2 1,5% (Handayani, 2008),

sedangkan β-karoten dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO2 dan

terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO2 5% (Rumanthi,2008). Hasil ini

dapat dijadikan pertimbangan bahwa asam lemak yang belum terpisah dari β -karoten dalam ekstrak buah kuning akan bereaksi dengan MnO2 pada kisaran

konsentrasi >1,5 % dan <5%, sehingga konsentrasi MnO2 yang digunakan adalah

3% dan 5%.

a b

Gambar 12. Plat KLT ekstrak buah kuning dengan modifikasi Si-Al (2:3)+MnO2

(a). 3% dan (b). 5%

Pemisahan dengan komposisi MnO2 5% menghasilkan 4 spot dengan jarak

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

rf sebesar 0,8; 0,6; 0,3 dan 0,25. Pada pemisahan dengan komposisi MnO2 3%

menghasilkan 4 spot dengan jarak rf sebesar 0,78; 0,67; 0,33; dan 0,11 seperti terlihat pada gambar 11. Warna sampel sebelum proses penotolan adalah kuning, dan pada saat ditotolkan pada plat modifikasi warna ini menjadi pudar. Kemungkinan yang terjadi adalah warna sampel tertutup oleh warna plat yang gelap (abu-abu kehitaman), atau dapat dikarenakan langsung terjadi reaksi antara sampel dengan fase diam saat ditotolkan. Pada saat sampel dielusi tidak diindikasikan adanya perubahan warna, namun setelah sampel selesai dielusi dan dikeringkan terlihat adanya dua spot yang tidak berwarna. Plat kemudian disemprot dengan Rhodamin B dan diamati menggunakan sinar UV. Hasil yang diperoleh adalah 4 spot dengan karakteristik warna yang hampir sama kecuali spot pertama yang terlihat lebih jelas sedangkan spot yang lain terlihat agak pudar. Spot pertama diindikasikan sebagai campuran asam lemak dalam bentuk trigliserida dan β-karoten yang telah bereaksi dengan MnO2. Spot ketiga dan

keempat merupakan asam lemak bebasnya. Spot kedua dengan jumlah yang paling sedikit merupakan sisa karoten yang tidak bereaksi dengan asam lemak dan MnO2.

Pemisahan menggunakan konsentrasi MnO2 5% menunjukkan

karakteristik warna yang sama dengan pemisahan menggunakan konsentrasi MnO2 3%, perbedaan terdapat pada harga Rf-nya. Pada konsentrasi MnO2 3%

jarak antar spotnya relatif lebih jauh yang menunjukkan bahwa resolusinya lebih baik. Pada komposisi MnO2 5% spot ketiga tidak terpisah dengan spot keempat.

Komposisi pada perbandingan silika dan alumina 2:3 dan penambahan MnO2 3%

mampu menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang baik dan harga Rf yang lebih tinggi serta tidak mengurangi jumlah spot yang dihasilkan dan karakter warna masing-masing spot, sehingga campuran fase diam inilah yang digunakan untuk pemisahan dengan kromatografi kolom.

Berdasarkan penentuan fasa gerak dan fasa diam dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom untuk hasil pemisahan yang lebih baik. Fasa diam yang digunakan adalah campuran silika dan alumina dengan perbandingan 2:3 dan penambahan MnO2 3%. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah petroleun

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1.

C. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Flash

Pemisahan dengan kromatografi kolom menggunakan kolom berdiameter 2 cm dan panjang 25cm. Total fasa diam yang digunakan adalah 50 g, dengan perincian MnO2 1,5 g, Silika 19,4 g, dan alumina 29,1 g. Alumina mempunyai

berat molekul yang lebih besar daripada silika gel, sedangka MnO2 mempunyai

berat yang paling ringan sehingga MnO2 akan selalu berada paling atas pada

permukaan kolom. Agar reaksi dapat berjalan sempurna maka MnO2 harus dibuat

sehomogen mungkin dengan yang lain. Salah satu cara adalah dengan metode kering yaitu dengan memasukkan campuran fasa diam ke dalam kolom yang berisi pelarut yang paling non polar yaitu PE. Campuran dimasukkan sedikit demi sedikit dengan komposisi yang sama sehingga akan terbentuk lapisan-lapisan yang teratur dalam kolom seperti pada gambar 12.

Gambar 13. Kromatografi kolom flash

Fasa gerak yang digunakan adalah petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi gradien yang dimulai dari perbandingan fasa gerak yang paling non polar. Asam lemak merupakam senyawa non polar sehingga digunakan campuran fasa gerak yang lebih non polar terlebih dahulu agar asam lemak lebih cepat terpisah. Kolom yang digunakan adalah kolom tekan, sehingga kecepatan alir dari fasa gerak dapat diatur. Semakin cepat kecepatan alir fasa gerak, semakin kecil tekanan dalam 33

commit to user

Tabel 6. Perbandingan data GC-MS dengan kandungan dalam ekstrak buah kuning

Data GC-MS Asam Lemak dalam

Ekstrak Buah kuning (Budi,2004)

Ekstrak murni Fraksi pertama

% Area

senyawa %

area

senyawa Asam

Lemak

% Kandungan

- - - - Asam

myristat

0,055

- - - - Asam

pentadekanoat

0,182

20,31 metil palmitat

15,95 metil palmitat Asam palmitat

10,083

- - 1,51 metil stearat Asam stearat 3,154

- - 0,88 metil

palmitoleat

Asam palmitoleat

1,377

79,69 Metil oleat

77,48 metil oleat Asam oleat 49,83

- - - - Asam

linolenat

0,504

- - - - Asam linoleat 6,307

- - - - Asam

eikosanoat

0,159

- - - - Asam behenat 0,852

- - 1,16 Metil

heptakosanoat

- -

- - 1,38

1-0- oktadekanoil-1,2-ethanadiol

- -

- - 1,62

glikol-1-palmitat

- -

Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan senyawa dari ekstrak murni. Pada saat pemisahan akan terjadi degradasi warna dari senyawa murni yang berwarna kuning pekat hingga diperoleh fraksi-fraksi yang berwarna kuning sampai warna kuning hilang secara permanen. Adanya degradasi ini

commit to user

mengindikasikan adanya pemisahan senyawa sehingga pada saat dianalisis, kromatogram menunjukkan waktu retensi yang berbeda untuk senyawa yang dideteksi sama, yaitu metil palmitat dan metil oleat pada ekstrak murni dan fraksi trigliseridanya. Berdasarkan literatur disebutkan bahwa selain asam oleat dan asam palmitat, ekstrak buah kuning juga mengandung asam pentadekanoat, asam myristat, asam stearat, asam palmitoleat, asam linoleat, asam linolenat, dan asam eikosanoat. Pada hasil GC-MS senyawa murni asam lemak ini tidak muncul, tetapi pada hasil GC-MS fraksi pertama muncul asam palmitoleat sebagai asam palmitoleat, asam stearat sebagai metil stearat.

Berdasarkan hasil analisis teridentifikasi tiga senyawa baru yang tidak terindetifikasi pada ekstrak murni maupun penelitian yang dilakukuan sebelumnya oleh Budi (2004). Senyawa tersebut adalah 1-0-oktadekanoil-1,2-ethanadiol dengan rumus formula C20H40O3 dan glikol-1-palmitat dengan rumus formula

C21H44O3. Munculnya senyawa glikol dan diol terbentuk karena dua atom H pada

trigliserida tersubsitusi oleh atom OH. Asam lemak tak jenuh dalam trigliserida dapat mengalami oksidasi yang diawali dengan terbentuknya radikal bebas dengan oksigen membentuk glikol. Adanya senyawa glikol dan diol dihasilkan dari oksidasi tidak sempurna pada trigliseridanya. Senyawa yang lain adalah metil heptakosanoat yang mengindikasikan bahwa dalam ekstrak buah kuning mengandung asam heptakosanoat. Apabila di bandingkan hasil identifikasi fraksi pertama dengan ekstrak buah kuning murni selisih % kandungan terbanyak adalah pada metil palmitat sehingga terbentuknya senyawa baru tersebut berasal dari asam palmitat yang terdapat pada fraksi trigliserida. Sememtara pada fraksi trigliserida dari ekstrak buah merah selisih % kandungan terbanyak dengan ekstrak murninya terdapat pada metil oleatnya. Hal ini mengindikasikan terbentuknya senyawa dioktil pthalat berasal dari asam oleatnya.

D. Pengaruh Penambahan Alumina dan MnO2

Alumina yang digunakan dalam penelitian ini adalah alumina basa, sifat kebasaan dalam alumina sering menyebabkan reaksi sekunder. Sebagai misal, ia dapat menyebabkan kondensasi dari aldehid-aldehid dan keton-keton, hingga bila 45

commit to user

hal ini terjadi dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai senyawa seperti terpen dan sterol (Sastrohamidjoyo, 2002). Alumina merupakan katalis basa yang mempunyai atom oksigen dengan muatan yang tinggi serta pH mendekati 10. Adanya alumina dapat meningkatkan aktivitas dari MnO2 sebagai oksidator yaitu

dengan memberikan elektronnya pada MnO2 sehingga MnO2 dapat dengan mudah

melepaskan oksigennya.

Pada konsentrasi MnO2 3%, kemungkinan yang terjadi adalah asam lemak

yang berada dalam bentuk trigliserida bereaksi terlebih dahulu dengan oksidatornya meskipun reaksi akan terhalang oleh keberadaan senyawa antioksidan yang berupa β-karoten dan tokoferol mengingat kedua senyawa ini

adalah senyawa yang mudah teroksidasi. Kemungkinan yang terjadi β-karoten akan teroksidasi terlebih dahulu untuk melindungi oksidasi asam lemaknya.

Setelah β-karoten habis oksidasi asam lemak terjadi tetapi terhalang oleh senyawa antioksidan yang lain. Kemungkinan yang lain asam lemak teroksidasi terlebih dahulu tetapi dihalangi oleh keberadaan senyawa antioksidan mengingat kandungan terbesar dalam ekstrak adalah asam lemak.

E. Pengaruh keberadaan antioksidan dalam ekstrak buah kuning Antioksidan yang terdapat pada ekstrak buah kuning adalah β-karoten dan tokoferol. Kedua senyawa ini merupakan senyawa aktif dalam ekstrak buah yang mampu menangkal adanya radikal bebas dalam tubuh. Keduanya juga merupakan senyawa yang mudah teroksidasi. Pada saat ketiganya berada bersamaan dengan konsentrasi oksidator tertentu, maka akan terjadi reaksi yang dapat menyebabkan perubahan dan dimungkinkan bersifat toksik.

Dari hasil kromatogram GC-MS pada fraksi asam lemak tidak dideteksi adanya senyawa turunan dari asam lemak. Hal ini mengindikasikan bahwa ada pengaruh dari senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak buah kuning yaitu β -karoten dan tokoferol. Penambahan antioksidan dalam konsentrasi rendah dapat menghambat dan atau mencegah reaksi autooksidasi pada lipida. Penambahan ini menghalangi reaksi oksidasi lipida pada tahap terminasi maupun propagasi. Mekanisme ini sering digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan.

commit to user

Mekanismenya adalah pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). pada tahap selanjutnya, yaitu propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi (reaksi 2). Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang asam lemak menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak baru (reaksi 3).

Inisiasi : RH R* + H* (1) Propagasi : R* + O2 ROO* (2) ROO* + RH ROOH +R* (3)

Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti aldehida dan keton. Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks bukan radikal (reaksi 4).

Terminasi : ROO* +ROO* non radikal (reaksi 4) R* + ROO* non radikal

R* + R* non radikal

Antioksidan yang baik akan bereaksi dengan radikal asam lemak segera setelah senyawa tersebut terbentuk. Dari berbagai antioksidan yang ada, mekanisme kerja serta kemampuannya sebagai antioksidan sangat bervariasi. Seringkali, kombinasi beberapa jenis antioksidan memberikan perlindungan yang lebih baik (sinergisme) terhadap oksidasi dibanding dengan satu jenis antioksidan saja (Medikasari, 2002). Kombinasi antara β-karoten dan tokoferol dalam ekstrak buah kuning dapat menghalangi oksidasi asam lemaknya. Hal ini dibuktikan dari tidak adanya derivat asam lemak pada spektra GC-MS.

Fenomena ini berbeda dengan pemisahan pada ekstrak buah merah. Pada ekstrak buah merah murni yang dipisahkan dengan modifikasi yang sama dihasilkan senyawa turunan asam lemak yaitu dioktil p-thalat. Perbedaan hasil ini dimungkinkan karena perbedaan kadar asam lemak tak jenuh dan perbedaan 47

commit to user

kadar senyawa antioksidan yaitu β-karoten dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah kuning.

Berdasarkan penelitan ini dapat diketahui bahwa keberadaan senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning mampu menangkal radikal bebas yang dihasilkan dari reaksi oksidasi asam lemaknya. Sehingga ekstrak buah kuning aman dikonsumsi secara langsung. Kelebihan asam lemak dalam tubuh akan disimpan dalam bentuk trigliserida sebelum masuk pada jalur asam lemak.

commit to user BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A.Kesimpulan

1. Dari hasil penelitian dan pembahasan dapat diambil kesimpulan bahwa dengan teknik kromatografi kolom yang dimodifikasi fasa diamnya yaitu dengan penambahan alumina basa pada silika dan MnO2 3% trigliserida

terpisah dari asam lemak bebas pada ekstrak buah kuning yang terbentuk dari hasil modifikasi.

2. Dari hasil pemisahan ini pada fraksi trigliseridanya tidak dihasilkan senyawa turunan dioktil pthalat sebagai senyawa turunan asam lemak. Sedangkan untuk fraksi trigliserida pada ekstrak buah merah dapat dihasilkan senyawa dioktil pthalat. Perbedaan hasil ini disebabkan karena perbedaan jenis asam lemak yang bereaksi dengan oksidator.

B.Saran

Berdasarkan kesimpulan diatas hendaknya dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai:

1. Mekanisme penghambatan reaksi oksidasi oleh β-karoten dan tokoferol dalam pemisahan trigliserida menggunakan teknik modifikasi fasa diam kromatografi untuk mengetahui manakah yang dominan menghambat reaksi oksidasi.

2. Identifikasi fraksi kedua jika fraksi dipisahkan dan dikumpulkan dalam jumlah yang banyak sehingga dapat diketahui jenis asam lemak dan senyawa lain.