commit to user
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Persiapan Sampel
Ekstrak buah kuning yang digunakan dalam penelitian ini berupa cairan minyak berwarna cokelat kekuningan. Preparasi awal sampel adalah clean up
ekstrak buah kuning menggunakan whatman TF dengan ukuran pori 0,2 µm. Filter ini dibuat dengan menggunakan membran PTFE Politetrafluoroethylene
yang spesifik untuk pemisahan senyawa organik, filtrasi pelarut non air dan ideal digunakan pada analisis HPLC, TLC, dan GC. Metode yang digunakan untuk
clean up adalah metode injeksi. Sebanyak 1 gram ekstrak buah dilarutkan dalam 10 ml dietil eter, ekstrak kemudian diinjeksikan pada syring hingga diperoleh
ekstrak encer. Ekstrak dibiarkan agar pelarut menguap hingga diperoleh ekstrak pekat kembali.
Tujuan utama clean up adalah membersihkan pengotor dan matriks- matriks lain dalam ekstrak buah kuning yang dapat mengganggu pemisahan.
Ekstrak awal berwarna cokelat kekuningan dan setelah dilakukan clen up diperoleh ekstrak berwarna kuning pekat. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak
telah bersih dari pengotor dan matriks-matriks lain yang dapat menggangu pemisahan seperti senyawa tanin dan selulosa.
B. Penentuan Fasa Gerak dan Fasa Diam
Pemisahan trigliserida dalam ekstrak buah kuning diawali dengan penentuan komposisi fasa diam dan fasa gerak yang akan digunakan. Penentuan
ini dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis KLT. Fasa gerak yang akan digunakan dalam kromatografi kolom ditentukan dengan menggunakan
plat TLC silica gel 60 F
254
. Trigliserida dan β-karoten merupakan senyawa non-
polar yang saling bercampur satu sama lain. Kedua senyawa tersebut dapat larut dalam eluen petroleum eter dan dietil eter sehingga digunakan larutan
pengembang PE dan dietil eter. Perbandingan larutan pengembang yang digunakan adalah 19:1, 9:1, 7:3, 1:1. Harga rf dari spot yang dihasilkan terlihat
29
commit to user pada tabel 4. Perbandingan yang digunakan adalah perbandingan fasa gerak yang
memberikan spot terbanyak dengan harga rf yang tinggi. Tabel 4. Harga Rf dari spot hasil pemisahan ekstrak buah kuning gambar
plat terlampir pada lampiran 2
Fasa diam Silika Gel
Silika gel : Alumina 2:3
19:1 Warna
9:1 warna
7:3 warna
1:1 warna
1:1 Warna
0,53
kuning
0,58
kuning
0,68
kuning
0,8
kuning
0,8
kuning
- -
-
- -
- -
- 0,2
Tak berwar
na
Perbandingan eluen PE:Dietil eter lama-kelamaan menjadi pudar kemungkinan karena
β-karoten teroksidasi
Hasil terbaik diperoleh pada perbandingan 1:1 dimana dihasilkan satu spot berwarna kuning dengan harga rf sebesar 0,8. Untuk perbandingan fasa gerak
yang lebih non polar yaitu pada perbandingan 19:1 dan 9:1 dihasilkan spot yang tailing dan harga rf rendah, ketika kepolaran dinaikkan dihasilkan satu spot
tunggal dengan harga rf yang relatif rendah sehingga perlu dinaikkan lagi kepolarannya hingga dihasilkan spot yang tidak tailing dan nilai rf tinggi. Adanya
satu spot mengindikasikan bahwa ekstrak kurang dapat terpisah dengan fasa diam silika gel saja. Untuk hasil pemisahan yang lebih baik adalah dengan
pencampuran fasa diam antara silika gel dengan alumina. Alumina merupakan adsorben kuat sehingga interaksinya mengikat solut juga lebih kuat dibanding
silika. Hal ini mengakibatkan senyawa-senyawa dalam ekstrak buah kuning yang bersifat polar akan semakin tertahan didalam fasa diam sedangkan senyawa non
polar akan terelusi lebih cepat. Alumina yang digunakan adalah alumina yang teraktifasi basa. Sifat basa pada alumina dapat menyebabkan reaksi saponifikasi
pada trigliserida yang akan berpengaruh pada hasil pemisahan. Penentuan perbandingan yang digunakan antara silika gel dengan alumina
berdasarkan pada acuan penelitian sebelumnya bahwa asam lemak dan β-karoten
dalam ekstrak buah merah terpisah terpisah baik pada perbandingan 2:3 30
commit to user Handayani; Rumanthi, 2008. Diduga terjadi hal yang sama untuk pemisahan
ekstrak buah kuning. Pada perbandingan ini dihasilkan 2 spot dengan harga rf pada tabel 4. Spot pertama berwarna kuning, namun agak memudar jika dibiarkan
terlalu lama. Spot kedua tidak berwarna dan akan tampak apabila disemprot dengan rhodamin B dan dilihat menggunakan lampu UV. Rhodamin B adalah
reagen yang digunakan untuk untuk menguji adanya trigliserida dan asam lemak Jork,1990. Adanya spot kedua mengindikasikan bahwa asam lemak bebas pada
ekstrak buah kuning telah terpisah dari trigliseridanya. Kombinasi fasa diam antara silika dengan alumina untuk mendapatkan
hasil pemisahan yang paling baik sedangkan untuk pengubahan senyawanya dilakukan dengan penambahan MnO
2
. MnO
2
berfungsi sebagai oksidator yang dapat mengoksidasi trigliserida. Komposisi MnO
2
yang ditambahkan adalah 3 dan 5. Asam lemak dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO
2
dan terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO
2
1,5 Handayani, 2008, sedangkan β-karoten dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO
2
dan terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO
2
5 Rumanthi,2008. Hasil ini dapat dijadikan pertimbangan bahwa asam lemak yang
belum terpisah dari β- karoten dalam ekstrak buah kuning akan bereaksi dengan MnO
2
pada kisaran konsentrasi 1,5 dan 5, sehingga konsentrasi MnO
2
yang digunakan adalah 3 dan 5.
a b Gambar 12. Plat KLT ekstrak buah kuning dengan modifikasi Si-Al 2:3+MnO
2
a. 3 dan b. 5 Pemisahan dengan komposisi MnO
2
5 menghasilkan 4 spot dengan jarak 31
commit to user rf sebesar 0,8; 0,6; 0,3 dan 0,25. Pada pemisahan dengan komposisi MnO
2
3 menghasilkan 4 spot dengan jarak rf sebesar 0,78; 0,67; 0,33; dan 0,11 seperti
terlihat pada gambar 11. Warna sampel sebelum proses penotolan adalah kuning, dan pada saat ditotolkan pada plat modifikasi warna ini menjadi pudar.
Kemungkinan yang terjadi adalah warna sampel tertutup oleh warna plat yang gelap abu-abu kehitaman, atau dapat dikarenakan langsung terjadi reaksi antara
sampel dengan fase diam saat ditotolkan. Pada saat sampel dielusi tidak diindikasikan adanya perubahan warna, namun setelah sampel selesai dielusi dan
dikeringkan terlihat adanya dua spot yang tidak berwarna. Plat kemudian disemprot dengan Rhodamin B dan diamati menggunakan sinar UV. Hasil yang
diperoleh adalah 4 spot dengan karakteristik warna yang hampir sama kecuali spot pertama yang terlihat lebih jelas sedangkan spot yang lain terlihat agak pudar.
Spot pertama diindikasikan sebagai campuran asam lemak dalam bentuk trigliserida dan β-karoten yang telah bereaksi dengan MnO
2
. Spot ketiga dan keempat merupakan asam lemak bebasnya. Spot kedua dengan jumlah yang
paling sedikit merupakan sisa karoten yang tidak bereaksi dengan asam lemak dan MnO
2.
Pemisahan menggunakan
konsentrasi MnO
2
5 menunjukkan
karakteristik warna yang sama dengan pemisahan menggunakan konsentrasi MnO
2
3, perbedaan terdapat pada harga Rf-nya. Pada konsentrasi MnO
2
3 jarak antar spotnya relatif lebih jauh yang menunjukkan bahwa resolusinya lebih
baik. Pada komposisi MnO
2
5 spot ketiga tidak terpisah dengan spot keempat. Komposisi pada perbandingan silika dan alumina 2:3 dan penambahan MnO
2
3 mampu menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang baik dan harga Rf yang
lebih tinggi serta tidak mengurangi jumlah spot yang dihasilkan dan karakter warna masing-masing spot, sehingga campuran fase diam inilah yang digunakan
untuk pemisahan dengan kromatografi kolom. Berdasarkan penentuan fasa gerak dan fasa diam dilakukan pemisahan
dengan kromatografi kolom untuk hasil pemisahan yang lebih baik. Fasa diam yang digunakan adalah campuran silika dan alumina dengan perbandingan 2:3 dan
penambahan MnO
2
3. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah petroleun 32
commit to user eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1.
C. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Flash
Kategori