Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Flash

commit to user eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1.

C. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Flash

Pemisahan dengan kromatografi kolom menggunakan kolom berdiameter 2 cm dan panjang 25cm. Total fasa diam yang digunakan adalah 50 g, dengan perincian MnO 2 1,5 g, Silika 19,4 g, dan alumina 29,1 g. Alumina mempunyai berat molekul yang lebih besar daripada silika gel, sedangka MnO 2 mempunyai berat yang paling ringan sehingga MnO 2 akan selalu berada paling atas pada permukaan kolom. Agar reaksi dapat berjalan sempurna maka MnO 2 harus dibuat sehomogen mungkin dengan yang lain. Salah satu cara adalah dengan metode kering yaitu dengan memasukkan campuran fasa diam ke dalam kolom yang berisi pelarut yang paling non polar yaitu PE. Campuran dimasukkan sedikit demi sedikit dengan komposisi yang sama sehingga akan terbentuk lapisan-lapisan yang teratur dalam kolom seperti pada gambar 12. Gambar 13. Kromatografi kolom flash Fasa gerak yang digunakan adalah petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi gradien yang dimulai dari perbandingan fasa gerak yang paling non polar. Asam lemak merupakam senyawa non polar sehingga digunakan campuran fasa gerak yang lebih non polar terlebih dahulu agar asam lemak lebih cepat terpisah. Kolom yang digunakan adalah kolom tekan, sehingga kecepatan alir dari fasa gerak dapat diatur. Semakin cepat kecepatan alir fasa gerak, semakin kecil tekanan dalam 33 commit to user kolom kromatografi sehingga reaksi semakin cepat tetapi reaksi tidak maksimal sehingga hasil pemisahan kurang sempurna. Sebaliknya, semakin lambat kecepatan alir fasa gerak, semakin besar tekanan dalam kolom dan semakin maksimal reaksi yang terjadi sehingga akan diperoleh hasil pemisahan yang lebih sempurna. Kecepatan alir yang digunakan dalam penelitian ini adalah 26 tetes per menit dan hasil pemisahan ditampung pada tabung reksi kecil setiap 3 ml. Fraksi yang pertama tertampung berwarna kuning yang merupakan campuran asam lemak dalam bentuk trigliserida dan β-karoten yang telah bereaksi dengan MnO 2 . Kemudian warna kuning tersebut semakin lama semakin hilang secara keseluruhan. Hasil elusi yang telah ditampung dalam tabung masing-masing diuapkan dari pelarutnya dan ditimbang serta diuji dengan plat silika gel menggunakan larutan pengembang petroleun eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1. Berat yang diperoleh dapat dilihat pada gambar 14. Gambar 14. Grafik perubahan massa tabung hasil pemisahan dengan kromatografi kolom flash. Diagram berat eluat dari pemisahan kolom modifikasi menghasilkan dua puncak yang kemudian eluat yang membentuk kedua puncak tersebut dikumpulkan menjadi satu sehingga didapat dua fraksi. Masing-masing tabung dianalisis dengan KLT menggunakan plat silika gel murni untuk mengelompokkan ke dalam fraksi yang sama. Harga Rf dari masing-masing fraksi dapat dilihat pada tabel 5. Asam lemak dalam ekstrak buah kuning terdapat dalam bentuk trigliserida dan pada pemisahan asam lemak dengan kromatografi kolom yang terpisah 34 commit to user pertama kali adalah trigliserida dan diikuti dengan asam lemak bebasnya, digliserida dan monogliserida Holme,2005. Asam lemak bebas merupakan asam lemak yang telah terpisah dari trigliserida, digliserida dan monogliseridanya. Tabel 5. Harga Rf, warna dan berat total tiap fraksi Fraksi ke- Tabung ke- rf warna Berat total Identifika si dengan rodamin Identifi kasi dengan SbCl 3 1 9-19 0,74 Kuning ± 681 mg Merah keunguan merah 2 20-29 0,40 Tak berwarna ± 23 mg Merah keunguan merah 3 30-40 0,15 Tak berwarna ± 221 mg Merah keunguan jingga · Bentuk spot tidak sama dengan hasil sebenarnya Gambar 15. Perbandingan Rf plat silika gel awal dengan Rf dari eluat Masing-masing fraksi dianalisis KLT menggunakan plat silika gel dan masing-masing fraksi dihasilkan satu spot. Perbandingan mengunakan plat silika gel awal dengan plat silika gel dari fraksi yang telah melalui modifikasi diperoleh bahwa asam lemak dalam ekstrak buah kuning dapat mengalami perubahan yaitu adanya asam lemak bebas yang diturunkan dari hasil modifikasi. Spot ketiga merupakan asam lemak bebas karena oksidasi dari asam lemak dapat meningkatkan kadar asam lemak bebasnya. Uji skrining fitokimia terhadap fraksi 35 commit to user kedua dihasilkan bahwa komponen senyawa dari fraksi kedua mengandung asam lemak dan karotenoid. Asam lemak yamg dihasilkan pada fraksi kedua dimungkinkan adalah sisa trigliserida yang tidak bereaksi dengan MnO 2 dan senyawa antioksidan, sedangkan karotenoid pada fraksi kedua adalah sisa karoten yang tidak bereaksi dengan MnO 2 . Ekstrak buah kuning yang dipisahkan dengan plat silika gel menggunakan eluen PE:dietil eter 1:1 diperoleh satu spot dengan rf 0,8. Setelah dilakukan modifikasi dengan kolom kromatografi masing-masing tabung dianalisis KLT dengan plat silika dan diperoleh spot tambahan untuk fraksi yang mengandung asam lemak yang mengindikasikan asam lemak yang semula tidak terpisah menjadi terpisah. Fraksi yang dianalisis adalah fraksi pertama dengan harga rf 0,74. menurut Holme 2005 dinyatakan bahwa jika asam lemak dipisahkan dengan silika yang terpisah pertama kali adalah fraksi trigliserida diikuti oleh asam lemak bebas kemudian digliseridamonogliseridanya. Dengan kondisi yang sama pada Holme dapat diperoleh hasil yang sama yaitu fraksi pertama adalah fraksi trigliserida. Pada penelitian ini diambil hanya fraksi pertama saja yaitu dengan berat terbanyak karena penelitian hanya ditekankan pada fraksi yang semula tidak terpisah dengan plat silika saja menjadi terpisah dengan modifikasi, selain itu dengan modifikasi yang sama yang dilakukan pada ekstrak buah merah ada senyawa turunan yang masuk pada fraksi trigliserida. Identifikasi Senyawa Fraksi pertama diencerkan dengan PE dan dianalisis dengan IR untuk mengetahui gugus fungsi apa saja yang terdapat pada fraksi pertama. Analisis spektrofotometer FT-IR terhadap fraksi pertama dari ekstrak buah kuning memberikan puncak-puncak serapan pada daerah bilangan gelombang seperti yang ditunjukkan pada gambar 16. 36 commit to user Gambar 16. Puncak-puncak serapan analisis FT-IR terhadap fraksi pertama. Dari hasil analisis spektroskopi FT-IR memberikan puncak spektrum dengan puncak-puncak pada daerah bilangan gelombang 2924,09 cm -1 dan 2854,65 cm -1 menunjukkan vibrasi stretching dari C-H sp 3 serta didukung pada daerah bilangan gelombang 1458,18 cm -1 yang menunjukkan vibrasi bending dari C-H sp 3 , munculnya puncak serapan pada daerah bilangan gelombang 1743,65 cm -1 menunjukkan adanya vibrasi gugus karbonil C=O dan pada daerah bilangan gelombang 1165,00 cm -1 menunjukkan vibrasi C-O-C dari ester yang merupakan serapan ester dari trigliserida serta didukung vibrasi dari alkil rantai panjang - CH 2 n pada daerah bilangan gelombang 725,23 cm -1 . Setelah diketahui gugus fungsi dari fraksi pertama dilakukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui golongan senyawa dengan GC-MS. GC-MS digunakan untuk mengidentifikasi senyawa yang dihasilkan pada fraksi pertama. Identifikasi ini digunakan untuk mengetahui jenis asam lemak apa saja yang terdapat pada fraksi pertama dan kemungkinan senyawa turunan yang dihasilkan. Sebagai dasar dilakukan analisis yang sama untuk ekstrak awal yaitu ekstrak buah kuning yang belum dilakukan pemisahan dengan kolom. Ekstrak awal dan fraksi pertama dianalisis dengan GC-MS model Shimadzu QP2010S dengan kondisi operasi tertera pada lampiran 2. Hasil kromatogram GC-MS disajikan dalam gambar 17. C-H sp 3 C=O O-C-O -CH 2 n C-H sp 3 37 commit to user Fraksi yang dianalisis ditransesterifikasi terlebih dahulu untuk menurunkan titik didihnya sehingga senyawa yang akan teridentifikasi adalah bentuk metil ester dari asam lemaknya. a b Gambar 17. a. Kromatogram GC ekstrak buah kuning murni b. kromatogram GC fraksi trigliserida Dari hasil analisis GC pada ekstrak dan ekstrak trigliserida diperoleh dua puncak utama yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa hampir tidak ada perbedaan antara ekstrak awal dengan fraksi trigliserida setelah dipisahkan dengan kromatografi kolom. Sehingga dimungkinkan reaksi oksidasi yang dimungkinkan terjadi pada ekstrak selama dikolom terhalang oleh keberadaan senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning. Identifikasi lebih lanjut dilakukan dengan spektroskopi massa, dari hasil spektroskopi massa akan diperoleh spektra massa dari masing-masing puncak yang terdeteksi pada kromatogram GC. Analisis spektra massa didasarkan pada nilai Similiarity Indeks SI yang dibandingkan dengan spektra dari library yaitu Wiley 229.LIB. spektra massa yang teridentifikasi dan spektra massa senyawa standar dari Wiley 229.LIB ditunjukkan pada lampiran 3 dan 4. Berikut analisis spectra massa senyawa yang terdeteksi dengan GC-MS 38 commit to user yang terkandung dalam ekstrak buah kuning awal dan dalam fraksi trigliserida dan dibandingkan dengan spectra massa senyawa standar dari Wiley 229 L.IB. a. Analisis terhadap ekstrak awal 1. Senyawa puncak 1 Senyawa puncak 1 dengan waktu retensi 25,627 menit dan kelimpahan 20,31 dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitat dengan Similiarity Indeks sebesar 96. Metal palmitat mempunyai rumus molekul C 17 H 34 O 2 dengan mz 270. 2. Senyawa puncak 2 Senyawa puncak 2 dengan waktu retensi 27,923 menit dan kelimpahan 79,69 dibandingkan dengan library adalah senyawa metil oleat dengan Similiarity Indeks sebesar 96. Metil oleat mempunyai rumus molekul C 19 H 36 O 2 dengan mz 296. 39 commit to user b. Analisis terhadap fraksi trigliserida 1. Senyawa puncak 1 Senyawa puncak 1 dengan waktu retensi 32,312 menit dan kelimpahan 0,88 dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitoleat dengan Similiarity Indeks sebesar 95 . Metal palmitoleat mempunyai rumus molekul C 17 H 32 O 2 dengan mz 236. 2. Senyawa puncak 2 Senyawa puncak 2 dengan waktu retensi 32,699 menit dan kelimpahan 15,95 dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitat dengan Similiarity Indeks sebesar 96 . Metil palmitat mempunyai rumus molekul C 17 H 34 O 2 dengan mz 270. 40 commit to user 3. Senyawa puncak 3 Senyawa puncak 3 dengan waktu retensi 35,842 menit dan kelimpahan 1,62 dibandingkan dengan library adalah senyawa glikol-1-palmitat dengan Similiarity Indeks sebesar 74 . Glikol-1-palmitat mempunyai rumus molekul C 21 H 44 O 3 dengan mz 272. 4. Senyawa puncak 4 Senyawa puncak 4 dengan waktu retensi 36,373 menit dan kelimpahan 77,48 dibandingkan dengan library adalah metil oleat dengan Similiarity Indeks sebesar 96 . Metil oleat mempunyai rumus molekul C 19 H 36 O 2 dengan mz 296. 41 commit to user 5. Senyawa puncak 5 Senyawa puncak 5 dengan waktu retensi 36,764 menit dan kelimpahan 1,51 dibandingkan dengan library adalah metil stearat dengan Similiarity Indeks sebesar 95. Metil stearat mempunyai rumus molekul C 19 H 38 O 2 dengan mz 298. 6. Senyawa puncak 6 Senyawa puncak 6 dengan waktu retensi 39,294 menit dan kelimpahan 1,38 dibandingkan dengan library adalah 1-0-oktadekanoil-1,2-etanediolbentuk senyawa diol dengan Similiarity Indeks sebesar 72. 1-0-oktadekanoil-1,2- etanediol mempunyai rumus molekul C 20 H 40 O 3 dengan mz 292. 42 commit to user 7. Senyawa puncak 7 Senyawa puncak 7 dengan waktu retensi 40,299 menit dan kelimpahan 1,16 dibandingkan dengan library adalah metil heptakosanoat dengan Similiarity Indeks sebesar 80. Metil heptakosanoat mempunyai rumus molekul C 28 H 56 O 2 dengan mz 283. Berdasarkan hasil analisis dapat diketahui bahwa tidak ada perbedaan signifikan antara ekstrak murni sebelum dikolom dengan fraksi pertama setelah dikolom. Terdapat persamaan pada dua puncak utama yaitu metil palmitat dan metil oleat dengan area berbeda. Pada ekstrak murni area untuk metil palmitat sebesar 20,31 sedangkan untuk metil oleat sebesar 79,69. Pada fraksi pertama dari hasil pemisahan terdapat penurunan dari keduanya yaitu metil palmitat sebesar 15,95 dan metil oleat sebesar 77,48. Hal ini mengindikasikan bahwa keberadaan senyawa lain dalam suatu komponen mempengaruhi hasil analisisnya. Esterifikasi tidak dapat mengubah seluruh trigliserida yang terdapat pada ekstrak murni menjadi metil ester karena adanya pengaruh senyawa lain yang dapat mengganggu proses esterifikasi dan memperbesar luas puncaknya. Kromatografi kolom mampu memisahkan senyawa dari komponen yang lain. Hasil analisis pada fraksi pertama yang sudah dipisahkan dengan kromatografi kolom menunjukkan luas area yang lebih sempit dengan puncak yang lebih tajam dan memaksimalkan proses esterifikasi sehingga puncak-puncak yang tidak terdeteksi pada ekstrak murni dapat muncul pada fraksi yang telah dipisahkan dengan kromatografi kolom. 43 commit to user Tabel 6. Perbandingan data GC-MS dengan kandungan dalam ekstrak buah kuning Data GC-MS Asam Lemak dalam Ekstrak Buah kuning Budi,2004 Ekstrak murni Fraksi pertama Area senyawa area senyawa Asam Lemak Kandungan - - - - Asam myristat 0,055 - - - - Asam pentadekanoat 0,182 20,31 metil palmitat 15,95 metil palmitat Asam palmitat 10,083 - - 1,51 metil stearat Asam stearat 3,154 - - 0,88 metil palmitoleat Asam palmitoleat 1,377 79,69 Metil oleat 77,48 metil oleat Asam oleat 49,83 - - - - Asam linolenat 0,504 - - - - Asam linoleat 6,307 - - - - Asam eikosanoat 0,159 - - - - Asam behenat 0,852 - - 1,16 Metil heptakosanoat - - - - 1,38 1-0- oktadekanoil- 1,2-ethanadiol - - - - 1,62 glikol-1- palmitat - - Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan senyawa dari ekstrak murni. Pada saat pemisahan akan terjadi degradasi warna dari senyawa murni yang berwarna kuning pekat hingga diperoleh fraksi-fraksi yang berwarna kuning sampai warna kuning hilang secara permanen. Adanya degradasi ini 44 commit to user mengindikasikan adanya pemisahan senyawa sehingga pada saat dianalisis, kromatogram menunjukkan waktu retensi yang berbeda untuk senyawa yang dideteksi sama, yaitu metil palmitat dan metil oleat pada ekstrak murni dan fraksi trigliseridanya. Berdasarkan literatur disebutkan bahwa selain asam oleat dan asam palmitat, ekstrak buah kuning juga mengandung asam pentadekanoat, asam myristat, asam stearat, asam palmitoleat, asam linoleat, asam linolenat, dan asam eikosanoat. Pada hasil GC-MS senyawa murni asam lemak ini tidak muncul, tetapi pada hasil GC-MS fraksi pertama muncul asam palmitoleat sebagai asam palmitoleat, asam stearat sebagai metil stearat. Berdasarkan hasil analisis teridentifikasi tiga senyawa baru yang tidak terindetifikasi pada ekstrak murni maupun penelitian yang dilakukuan sebelumnya oleh Budi 2004. Senyawa tersebut adalah 1-0-oktadekanoil-1,2-ethanadiol dengan rumus formula C 20 H 40 O 3 dan glikol-1-palmitat dengan rumus formula C 21 H 44 O 3 . Munculnya senyawa glikol dan diol terbentuk karena dua atom H pada trigliserida tersubsitusi oleh atom OH. Asam lemak tak jenuh dalam trigliserida dapat mengalami oksidasi yang diawali dengan terbentuknya radikal bebas dengan oksigen membentuk glikol. Adanya senyawa glikol dan diol dihasilkan dari oksidasi tidak sempurna pada trigliseridanya. Senyawa yang lain adalah metil heptakosanoat yang mengindikasikan bahwa dalam ekstrak buah kuning mengandung asam heptakosanoat. Apabila di bandingkan hasil identifikasi fraksi pertama dengan ekstrak buah kuning murni selisih kandungan terbanyak adalah pada metil palmitat sehingga terbentuknya senyawa baru tersebut berasal dari asam palmitat yang terdapat pada fraksi trigliserida. Sememtara pada fraksi trigliserida dari ekstrak buah merah selisih kandungan terbanyak dengan ekstrak murninya terdapat pada metil oleatnya. Hal ini mengindikasikan terbentuknya senyawa dioktil pthalat berasal dari asam oleatnya.

D. Pengaruh Penambahan Alumina dan MnO