Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL

KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK KULIT

BUAH MANGGIS (Garcinia mangostana L.)

TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS

HEPATITIS C

SKRIPSI

YUNITA SARI

NIM.109102000063

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL

KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK KULIT

BUAH MANGGIS (Garcinia mangostana L.)

TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS

HEPATITIS C

SKRIPSI

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far)

YUNITA SARI

NIM.109102000063

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063

Tanda Tangan :

iv

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Disetujui Oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Lina Elfita, M.Si.,Apt. A. Zaenal Mustopa, M.Si NIP. 197312122011012002 NIP. 197704122005021001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

v _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Lina Elfita, M.Si.,Apt. ( )

Pembimbing II : A. Zaenal Mustopa, M.Si. ( )

Penguji I : Ofa Suzanti Betha, M.Si.,Apt. ( )

Penguji II : Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D., Apt. ( )

Ditetapkan di : Jakarta

vi _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

ABSTRAK

Nama : Yunita Sari

Program Studi : Farmasi

Judul : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Virus hepatitis C termasuk anggota dalam genus hepacivirus dan famili flaviviridae yang merupakan penyebab penyakit hepatitis pada manusia di seluruh dunia. Penemuan senyawa-senyawa yang memiliki potensi sebagai inhibitor terhadap enzim yang essensial dalam proses replikasi pada virus HCV seperti enzim protease, RNA helikase, dan polimerase terus dilakukan. Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan pohon berbuah yang terdistribusi di Thailand, India, Srilanka, Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philipina, dan China. Pada beberapa penelitian telah dilaporkan bahwa ekstrak kulit buah manggis dan senyawa aktifnya memiliki aktivitas antimikroba, antifungi, antioksidan, antiinflamasi, dan bahkan anti HIV. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak metanol kulit buah manggis terhadap RNA Helikase HCV. Eluen yang digunakan pada kolom kromatografi ini adalah kloroform-metanol dengan perbandingan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9). Hasil fraksi kolom kromatografi ekstrak kulit buah manggis dibuat pada konsentrasi 2.500 ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan tertinggi pada fraksi ke-sembilan dengan eluen kloroform-metanol perbandingan 7:3 yaitu sebesar 81,2 % dengan aktivitas enzim RNA helikase HCV sebesar 87,36 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah manggis berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

Kata kunci : Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.), Kolom kromatografi, RNA helikase HCV

vii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

ABSTRACT

Name : Yunita Sari

Program Study : Pharmacy

Title : Inhibition Activity Test of Fractions Result Column Chromatography of Mangosteen (Garcinia mangostana L.) Pericarp Extract Against Hepatitis C Virus RNA Helicase

Hepatitis C virus including members of the Flaviviridae family, Hepacivirus genus and that is the cause of chronic hepatitis in humans worldwide. The discovery of compounds that have potential as inhibitor to essential enzyme in the process of replication HCV viral such as protease, RNA helicase and polymerase continues to be done. Mangosteen (Garcinia mangostana L.) is a fruit tree distributed in Thailand, India, Srilanka, Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philippines and China.Recently research has reported that extracts of mangosteen pericarp and active compounds of pharmacological activities such as antimicrobial, antifungal, antioxidant, antiinflammatory, and anti-HIV. This study aims to determine inhibition activity of fractions result column chromatography from methanol pericarp extract of mangosteen of HCV RNA helicase. Eluent used in the column chromatography with the ratio of chloroform-methanol (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9). Result of column chromatography fractions of pericarp extract of mangosteen was made with a concentration of 2.500 ppm. The results indicated that the highest inhibitory activity in fraction ninth with eluent chloroform-methanol 7:3 is 81.2% with the enzyme activity of HCV RNA helicase is 87.36 pmol phosphate/ml/min/pmol protein. These results indicate that pericarp extract of mangosteen has potential as inhibitor of HCV RNA helicase. Keywords : Pericarp of mangosteen (Garcinia mangostana L.), Column

viii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa, tanpa bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, sangatlah sulit bagi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

(1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Bapak Apon Zaenal Mustopa, M.Si. selaku pembimbing II, yang memiliki andil besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini.

(2) Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(3) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(4) Bapak dan Ibu dosen dan karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(5) Tim pengelola beasiswa santri jadi dokter Pemda Musi Banyuasin yang telah mendukung saya sehingga saya dapat mengenyam pendidikan di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

(6) Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Balakia dan Ibunda Faridah yang tak pernah henti mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis, untuk menyelesaikan tugas akhir ini.

ix _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

(7) Teman seperjuangan selama kuliah dan penelitian Fakhrul Umam.

(8) Keluarga besar Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI, bu Rifqiyah, om Ridwan, kak Linda, kak Putri, kak Yuni, kak Meita, kak Hana, mas Aris, kak Ike, kak Aksar, kak Bugi, Uud, kak Kus, kang Ace yang telah banyak membantu penulis dalam penelitian.

(9) Teman-teman Farmasi angkatan 2009 khususnya teman EDTA C, SJD Muba angkatan 2009 dan sahabat-sahabat tercinta Butet, Puput, Dwi, Ika, Ainul, dan Nurul yang berbagi suka, duka, keceriaan, dan semangat semasa kuliah hingga penyelesaian tugas akhir ini.

Akhir kata, semoga Allah SWT membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, untuk itu saran dan kritik tetap penulis harapkan untuk menjadikan tulisan ini lebih baik. Penulis berharap semoga skripsi ini memberikan manfaat dan sumbangan bagi kemajuan dan perkembangan ilmu pengetahuan di masa yang akan datang. Amiin Ya Robbal ‘Alamin.

Jakarta, September 2013 Penulis

x _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK KULIT BUAH MANGGIS (Garcinia

mangostana L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan diinternet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universita Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan pubikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Di buat di : Jakarta

Pada Tanggal : 27 September 2013

Yang menyatakan

xi _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iv

HALAMAN PENGESAHAN ... v

ABSTRAK ... iv

ABSTRACT ... v

KATA PENGANTAR ... vi

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ... x

DAFTAR ISI ... xi

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

DAFTAR ISTILAH ... xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ... 1

1.1 LatarBelakang ... 1

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah ... 3

1.3 Tujuan Penelitian ... 3

1.4 Manfaat Penelitian ... 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

2.1 Manggis (Garcinia mangostana L.) ... 4

2.1.1 Klasifikasi Tanaman ... 4

2.1.2 Deskripsi Tanaman ... 4

2.1.3 Kandungan Senyawa ... 5

2.1.4 Khasiat Manggis (Garcinia mangostana L.) ... 6

2.2 Ekstraksi ... 7

2.3 Virus Hepatitis C ... 7

2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C ... 9

2.5 SDS PAGE ... 12

2.6 Kolorimetri ATPase ... 13

2.7 Prinsip Kromatografi ... 13

2.8 Kolom Kromatografi ... 14

BAB 3. METODE PENELITIAN ... 15

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 15

3.2 Alat dan Bahan ... 15

3.3 Metode Penelitian ... 16

3.3.1 Pengambilan Sampel ... 16

3.3.2 Determinasi Sampel ... 16

3.3.3 Persiapan Simplisia ... 17

3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) ... 17

3.3.5 Rendemen Total Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) ... 17

xii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

3.3.7 Parameter dan Metode Uji Ekstrak ... 19

3.3.7.1 Parameter Non Spesifik ... 19

3.3.7.2 Parameter Spesifik... 19

3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ... 20

3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ... 21

3.3.10 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ... 22

3.3.11 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom kromatografi ... 23

3.3.12 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Manggis terhadap RNA Helikase HCV ... 24

3.3.13 Visualisasi Hasil Fraksi Kolom Kromatografi dengan Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis ... 25

3.3.14 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C ... 25

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 27

4.1 Determinasi Sampel ... 27

4.2 Rendemen Ekstrak ... 27

4.3 Penapisan Fitokimia ... 28

4.4 Parameter dan Metode Uji Ekstrak ... 30

4.5 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ... 31

4.6 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ... 33

4.7 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV ... 35

4.8 Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV ... 37

4.9 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C ... 40

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ... 43

5.1 Kesimpulan ... 43

5.2 Saran ... 43

DAFTAR PUSTAKA ... 45

xiii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 2.1 Inhibitor RNA Helikase HCV ... 11 Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis... 28 Tabel 4.2 Parameter dan Metode Uji Ekstrak ... 30

xiv _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) ... 4

Gambar 2.2 Virus Hepatitis C ... 9

Gambar 2.3 Mekanisme Kerja Enzim RNA Helikase ... 10

Gambar 4.1 Hasil SDS-PAGE RNA Helikase HCV ... 35

Gambar 4.2 Kurva Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV ... 38

Gambar 4.3 Profil Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV ... 39

Gambar 4.4 Visualisasi KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Metanol Kulit Buah manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV ... 40

xv _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil Determinasi (Garcinia mangostana L.) ... 49

Lampiran 2. Alur Penelitian ... 50

Lampiran 3. Alur Kerja Persiapan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) ... 51

Lampiran 4. Alur Kerja Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C . 52 Lampiran 5. Alur Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ... 53

Lampiran 6. Alur Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV ... 54

Lampiran 7. Alur Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV ... 55

Lampiran 8. Komposisi larutan-larutan yang digunakan dalam SDS-PAGE ... 56

Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan ... 57

Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis ... 58

Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis. ... 59

Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis ... 60

Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase HCV ... 61

Lampiran 14. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase HCV ... 62

Lampiran 15. Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap RNA Helikase HCV ... 64

Lampiran 16. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ... 65

Lampiran 17. Contoh Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ... 66

Lampiran 18. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan Senyawa Inhibitor Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) ... 67

xvi _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR ISTILAH APS : Ammonium Per Sulfat

ATP : Adenosin Trifosfat

IPTG : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase

IV : Inner volum

HCV : Hepatitis C Virus LB : Media Luria - Bertani

MOPS : 4-asam morfolinopropana sulfonat OD : Optical Density

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 1

PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Penyakit menular yang disebabkan oleh virus bukan suatu masalah baru di Indonesia dan juga merupakan masalah global yang perlu ditangani secara serius. Hepatitis C, misalnya, adalah salah satu penyakit menular yang disebabkan oleh infeksi virus hepatitis C yang merupakan golongan flavivirus. Virus hepatitis C ini merupakan penyakit penyebab kematian ke sepuluh didunia. Sekitar 12.000 orang meninggal pada tahun 2010 akibat infeksi virus hepatitis C di Amerika Serikat menurut US Centers for Disease Control And Prevention (CDC, 2012). Sedangkan berdasarkan data World Health Organization (2012), diperkirakan sekitar sepertiga dari populasi dunia atau sekitar 2 miliar orang saat ini terinfeksi oleh salah satu dari virus yang menyebabkan hepatitis, dengan angka kematian 350.000 orang per tahun dan 150 juta orang menderita penyakit virus hepatitis C.

Virus HCV ini dapat menyebar melalui penggunaan jarum suntik yang berulang, transfusi darah, hubungan seksual, dan hemodialisis (Sy & Jamal, 2006). Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini untuk hepatitis C kronis adalah pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan nukleosida analog ribavirin. Akan tetapi terapi ini memiliki tingkat efektivitas sekitar 40% – 50% terhadap infeksi HCV. Kombinasi ini memiliki efek samping seperti flu, anemia, dan depresi, yang sering menyebabkan penghentian terapi. Dengan demikian, diperlukan penelitian untuk menemukan agen baru dengan indeks terapi tinggi dan efek samping minimal untuk mengobati infeksi HCV kronis (Lee et al, 2010, Ravikumar et al, 2011).

Upaya dalam rangka menemukan obat baru yang efektif dalam pengobatan penyakit hepatitis C terus dilakukan dalam rangka menemukan obat yang benar-benar efektif untuk menghambat kerja virus HCV ini dan mengatasi masalah penyakit hepatitis C di Indonesia. Beberapa diantaranya adalah penemuan senyawa-senyawa yang memiliki potensi sebagai inhibitor

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta terhadap enzim yang essensial dalam proses replikasi pada virus HCV tersebut. Enzim-enzim essensial seperti enzim protease, RNA helikase, dan polimerase menjadi target utama peneliti dalam memperoleh senyawa inhibitor terhadap virus HCV ini.

Seperti pada enzim RNA helikase selain memiliki aktivitas RNA helikase itu sendiri, juga memiliki aktivitas ikatan RNA (RNA binding) dan ATPase (RNA-simulated ATPase), dan kedua aktivitas ini berpengaruh terhadap aktivitas RNA helikase. Dengan adanya inhibitor yang menghambat kerja RNA helikase, maka dapat menghambat proses replikasi virus yang merupakan tahapan penting dalam proses pertumbuhan virus. Oleh karena itu, enzim ini menjadi target yang potensial untuk penemuan obat antivirus (Utama et al, 2005).

Dalam beberapa tahun terakhir ini konsep “back to nature” terus menjadi pusat perhatian. Seperti pada penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Syajarwati (2013) menemukan adanya aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C dari ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.). Aktivitas ekstrak dalam beberapa fraksi pelarut yang paling optimal dalam menginhibisi RNA helikase pada virus HCV ini adalah pada fraksi ekstrak metanol sebesar 71,57% dengan konsentrasi 3.125 ppm. Kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) telah dilaporkan banyak memberikan aktivitas farmakologis seperti antimikroba, antioksidan, antifungi, antitumor, antiinflamasi, antialergi, antimalaria dan antiviral dan terus menaruh perhatian peneliti untuk melakukan isolasi terhadap senyawa yang memberikan aktivitas (Chaverri et al, 2008).

Penelitian ini memberikan gambaran bahwa ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) mempunyai potensi sebagai kandidat senyawa baru dalam menghambat kerja virus hepatitis C. Merujuk dari penelitian tersebut maka peneliti bermaksud untuk melakukan uji aktivitas inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 1.2 Batasan dan Rumusan Masalah

1.2.1 Batasan penelitian

Batasan penelitian yang dilakukan meliputi uji aktivitas inhibisi pada hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C.

1.2.2 Rumusan masalah

Pemanfaatan bahan alam sebagai kandidat penemuan obat baru untuk pengobatan penyakit hepatitis C masih terus diteliti sehingga diperoleh suatu senyawa murni yang benar-benar efektif dalam menghambat enzim RNA helikase virus hepatitis C. Untuk memperoleh suatu senyawa yang murni dari senyawa kompleks yang terdapat pada ekstrak bahan alam cukup sulit dan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Yang menjadi permasalahan dalam penelitian ini adalah : fraksi mana yang menghasilkan aktivitas inhibisi tertinggi terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C dari hasil kolom kromatografi ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.)?

1.3 Tujuan Penelitian

Mengetahui aktivitas inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C.

1.4 Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan memiliki kontribusi dan manfaat sebagai dasar upaya pemanfaatan bahan alam dalam pengobatan penyakit hepatitis C.

4

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Manggis (Garcinia mangostana L.)

2.1.1 Klasifikasi Tanaman Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Division : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Dilleniidae

Order : Theales

Family : Clusiaceae Genus : Garcinia L

Species : Garcinia mangostana L. (United State Departement of Agriculture, 2012)

Gambar 2.1 Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Sumber : dokumen pribadi

2.1.2 Deskripsi Tanaman

Garcinia mangostana Linn. adalah buah bersejarah yang dinamakan sebagai “ratu buah” dan buah yang paling segar. Bagian yang dapat dimakan berwarna putih, lembut dan manis, memberikan rasa yang sedikit

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta asam serta aroma yang menyenangkan. Tanaman ini terdistribusi di Thailand, India, Srilanka, Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philipina, dan China (Yu et al, 2006). Tanaman ini berasal dari Indonesia. Dengan tinggi pohon 7-8 m dengan dahan yang kuat dan besar, diketahui tumbuhan ini ditanam di wilayah Asia tenggara dan kemudian di budidayakan di daerah-daerah yang beriklim panas. Seringkali memerlukan iklim yang lembab untuk pertumbuhannya. Daun-daunnya kasar. Pohonnya berwarna coklat gelap, cukup keras dan padat. Warna kulit pohon bagian dalam kekuning-kuningan. Tangkai daunnya pendek dan tebal. Diameter bunganya 5 cm, dipisahkan menjadi 4 bagian. Bijinya lebar, gepeng dan melekat pada buahnya yang putih dan kemerah-merahan (Anthony, 2002).

Batang manggis ini berkulit cokelat dan bergetah. Tanaman ini berumah dua, bunga jantan dan betinanya dihasilkan oleh tanaman yang berbeda. Akan tetapi, bunga jantannya tidak berfungsi sebab mengalami rudimenter, yaitu mengecil dan mengering. Oleh karena itu, buah manggis selalu dihasilkan dari bunga betina yang berwarna merah muda secara apomiksis (tanpa proses penyerbukan). Bentuk daunnya merupakan daun tunggal, duduk daun berhadapan atau bersilang berhadapan. Warnanya mengkilat dipermukaan, permukaan atas hijau gelap permukaan bawah hijau terang. Bentuk elips memanjang, 12-23 x 4,5-10 cm, tangkai 1,5-2 cm. Bunga betina 1-3 di ujung batang, susunan menggarpu, garis tengah 5-6 cm. Kelopak daun, dua daun kelopak yang terluar hijau kuning, dua yang terdalam lebih kecil, bertepi merah, melengkung kuat, tumpul. Mahkota terdiri dari 4 daun mahkota, bentuk telur terbalik, berdaging tebal, hijau kuning, tepi merah atau hampir semua merah. Benang sari mandul biasanya dalam kelompok (Astika, 2013).

2.1.3 Kandungan Senyawa

Telah dilaporkan bahwa kulit dari Garcinia mangostana L. merupakan sumber dari senyawa mangostin, tannin, xanthon, isoflavon, flavon, dan substansi bioaktif lainnya (Yu et al, 2006). Xanthon yang telah diisolasi dari bagian pericarpium, buah, kulit kayu, dan daun buah manggis.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

α-, β-, dan ᵧ- mangostin, garcinon E, 8-deoxygartanin dan gartanin adalah yang paling banyak diteliti (Chaverri et al, 2008). Secara fitokimia pericarpium buah manggis kaya akan berbagai macam xanthon yang teroksigenasi dan terprenilasi termasuk α- dan ᵧ- mangostin, jenis xanthon ini menunjukkan sifat-sifat biologis yang unik seperti antimikroba, antifungi, antioksidan, antiinflamasi dan aktivitas sitotoksik (Watanapokasin et al, 2009).

2.1.4 Khasiat Manggis (Garcinia mangostana L.)

Masyarakat di berbagai negara sering menggunakan manggis sebagai pengobatan tradisional termasuk pengobatan nyeri perut, disentri, diare, luka bernanah, infeksi luka, keputihan, bisul kronis dan gonorhoea (Yu et al, 2006). Buah manggis (Garcinia mangostana L.) yang merupakan famili Clusiaceae telah digunakan di Asia Tenggara sebagai obat untuk infeksi kulit, diare, bisul kronis, dan luka. Xanthon yang memiliki aktivitas seperti antimikroba, antifungi, antioksidan, antiinflamasi, dan aktivitas sitotoksik (Watanapokasin et al, 2009).

Akhir-akhir ini, beberapa produk yang diproduksi dari Garcinia mangostana L. mulai digunakan sebagai suplemen diet alami di Amerika Serikat, karena memiliki potensi sebagai antioksidan. Metabolit sekunder utama dari manggis yang telah ditemukan adalah derivat xanthon yang terprenilasi; beberapa golongan senyawa ini telah diisolasi dari tanaman dan menunjukkan aktivitas antifungi, antimikroba, antioksidan, dan aktivitas sitotoksik (Jung et al, 2006).

Dari beberapa spesies Garcinia dilaporkan memiliki aktivitas sebagai inhibitor enzim protease HIV-1. Dan salah satunya adalah Garcinia mangostana L. yang memiliki senyawa mangostin sebagai senyawa yang signifikan menghambat enzim protease HIV-1 (Magadula et al, 2009). Beberapa penelitian telah melakukan uji aktivitas anti kanker terhadap xanthone yang diisolasi dari pericarpium buah manggis. Kemudian adanya fakta tentang aktivitas antialergi dan antiinflamasi dari Garcinia mangostana L. dengan menggunakan metode in vitro. Senyawa xanthon dan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ekstrak yang diperoleh dari Garcinia mangostana L. memiliki aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antivirus serta antimalaria (Chaverri et al, 2006).

2.2 Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain. Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan kedalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain (Depkes, 2000).

Ekstraksi adalah pemisahan beberapa bagian dari senyawa aktif yang berasal dari jaringan tumbuhan (dan hewan) dengan menggunakan pelarut selektif berdasarkan prosedur standar. Produk-produk yang dihasilkan dari tanaman meliputi senyawa metabolit kompleks, baik berupa cairan, semisolid atau dalam bentuk serbuk kering yang dapat digunakan untuk pemakaian oral maupun pemakaian luar (Tiwari et al, 2011).

2.3 Virus Hepatitis C

Virus hepatitis C adalah virus RNA yang memiliki untai nonsitopatik positif dan menyebabkan hepatitis akut dan kronis serta karsinoma hepatoseluler (Zhong et al, 2005). Virus hepatitis C termasuk anggota dalam genus hepacivirus dan famili flaviviridae yang merupakan penyebab penyakit hepatitis pada manusia di seluruh dunia (Baginski et al, 2000). Virus famili flaviviridae ini memiliki ukuran kecil, berselubung (envelope), partikel speris berdiameter 40-50 nm dengan untai tunggal, dan genom RNA sense positif (Borowski et al 2008). Partikel virus hepatitis C terdiri atas inti berupa RNA yang merupakan material genetik, kulit yang mengelilingi material genetik yang terbentuk dari protein berbentuk ikosahedral, dan terbungkus dalam selubung (envelope) asam lemak (Gambar 2.2 ). Dua selubung (envelope) glikoprotein virus, E1 dan E2 tertanam di dalam

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta selubung lipid (Op de Beeck & Dubuisson, 2003). Target alami dari virus hepatitis C adalah hepatosit dan limfosit B (Lauer & Walker, 2001). Virus hepatitis C memiliki 3 reseptor yang telah diidentifikasi yaitu CD81 (Cormier et al, 2004), human scavenger class B1 (SR-BI) (Mailard et al, 2006), dan claudin-1 (Evans et al, 2001).

Replikasi virus bersifat kuat dan dapat diperkirakan lebih dari sepuluh milyar partikel virion diproduksi perhari bahkan pada fase kronis dari infeksi. Virus hepatitis C mengkode poliprotein tunggal yang terdiri atas 3011 asam amino dan memproses menjadi 10 protein struktural dan regulator. Komponen struktural terdiri atas inti dan dua selubung protein. Selain inti dari virus terdapat juga dua daerah dari protein envelope E2 didesain sebagai daerah hipervariabel 1 dan 2 yang memiliki laju yang tinggi terhadap mutasi dan dipercaya sebagai hasil dari tekanan selektif oleh antibodi spesifik terhadap virus (Lauer & Walker, 2001).

Virus hepatitis C juga mengkode gen helikase spesifik virus, protease, dan polimerase. Protein-protein ini memiliki fungsi penting dalam siklus hidup virus. Protein-protein ini dijadikan target yang menarik untuk terapi antivirus.

Gambar 2.2 Virus Hepatitis C Sumber: Moradpour et al, 2007.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C

Enzim helikase adalah enzim yang terlibat dalam hampir semua aspek metabolisme DNA dan RNA. meskipun terdapat kemajuan terhadap pengetahuan mekanisme aksi dari enzim-enzim ini, resolusi yang terbatas menyebabkan mekanisme rinci seperti penataan ulang struktur asam nukleat hingga pengikatan dan hidrolisis ATP yang dilakukan pasangan enzim helikase ini tidak dapat diketahui (Dumont et al, 2006). Fungsi dasar enzim helikase untuk membuka untai ganda DNA atau RNA melalui coupling hidrolisis ATP dengan translokasi sepanjang satu untai DNA atau RNA (Fan et al, 2008).

Seluruh helikase virus memiliki aktivitas NTP/ATPase. Aktivitas ini tergantung pada adanya ATP dan kation divalen berupa Mg2+. Produk dari hidrolisis NTP pada setiap pengkajian helikase adalah ADP dan Pi. Aktivitas ATP dari helikase secara umum distimulasikan oleh keberadaan asam nukleat untai tunggal. Hal ini memungkinkan enzim berikatan dengan untai RNA dengan energi yang didapat dari hidrolisis ATP untuk memisahkan ikatan hidrogen pasangan basa dari struktur dupleks (Kim et al, 1998).

Enzim helikase diperlukan untuk proses replikasi genom organisme tersebut. Enzim helikase dapat dibagi menjadi DNA helikase dan RNA helikase, sesuai dengan genom yang dimiliki organisme tersebut. HCV yang merupakan virus RNA memiliki RNA helikase. Helikase bekerja secara katalitik memisahkan untai ganda DNA atau RNA menggunakan energi yang dihasilkan dari hidrolisis nukleosida trifosfat dan merupakan target pencarian obat karena dibutuhkan dalam replikasi virus. (Utama et al, 2000).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.3 Mekanisme Kerja Enzim RNA Helikase

Sumber : Utama et al, 2000

Aktivitas ATP helikase secara umum distimulasikan oleh keberadaan asam nukleat untai tunggal. Hal ini memungkinkan enzim berikatan dengan untai RNA dengan energi yang dihasilkan dari hidrolisis ATP untuk memisahkan ikatan hidrogen pasangan basa dari struktur dupleks (Utama et al, 2000).

Ikatan asam nukleat dapat menginduksi konformasi protein yang terkarakterisasi dengan pengembangan situs aktif dari domain ATPase dari ATP. Aktivitas ATPase tidak dapat distimulasi pada kadar garam tinggi. Hal ini disebabkan kondisi kekuatan ionik kuat asam nukleat tidak dapat terikat dengan enzim dan enzim membentuk konformasi untuk pelepasan untaian. Mekanisme kerja enzim RNA atau DNA helikase adalah pertama-tama helikase akan mengikat untai RNA atau DNA untai ganda pada ujung 3’, selanjutnya ATP akan berikatan pada suatu sisi aktif dari RNA atau DNA helikase tersebut. Gugus ATP akan dihidrolisis oleh enzim RNA atau DNA helikase menjadi ADP dan fosfat inorganik. Proses hidrolisis ini akan terlepas energi yang kemudian digunakan oleh enzim RNA atau DNA

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta helikase untuk menguraikan untai ganda RNA atau DNA menjadi untai tunggal RNA atau DNA (Utama et al, 2000).

Enzim helikase dapat menguraikan RNA atau DNA untai ganda melalui pemutusan ikatan hidrogen yang mengikat kedua untai tersebut. Reaksi ini berhubungan dengan hidrolisis ATP, di mana energi yang dilepaskan selama hidrolisis ATP dibutuhkan dalam proses penguraian RNA atau DNA (Shuman, 1992; Wagner et al, 1998).

Enzim helikase juga dapat berperan dalam fungsi selular lainnya seperti membantu proses translasi, mengkoordinasi pembentukan poliprotein, memutus interaksi RNA-protein, serta menyusun RNA di dalam pembungkus viral (Lam & Frick, 2006). Enzim helikase juga memiliki aktivitas ikatan RNA (RNA binding) dan ATPase (RNA-stimulated ATPase), dan kedua aktivitas ini berpengaruh terhadap aktivitas RNA helikase. Enzim ini menjadi target yang potensial untuk penemuan obat antivirus karena penemuan inhibitor RNA helikase dapat dilakukan dengan penemuan inhibitor terhadap aktivitas RNA binding atau ATPase (Utama et al, 2000).

Beberapa penelitian tentang mutasi dan penghambatan terhadap NS3 diperlukan untuk propagasi virus sehingga pengembangan inhibitor efektif dari enzim helikase virus hepatitis C adalah bagian penting dalam strategi antiviral. Pengembangan riset mengenai agen yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase terus ditegakkan, dalam rangka menemukan kandidat obat untuk menangani infeksi virus hepatitis C. Berikut adalah tabel riset beberapa agen yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

Tabel 2.1. Inhibitor RNA helikase HCV

No Inhibitor Persen

inhibisi

Pustaka

1 Protein kapang endofit CgKTm SF 89,45% Paturohman, 2011 2 Ekstrak metanol buah tanaman

mangrove Avicennia marina

76,705 % Kusumawati, 2011

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta (Forsk) Vierb.

3 Mikroalga BTM 11 81,205 % Putri, 2011a

4 Bakteriosin asam laktat S34 64,20 % Putri, 2011b. 5 Ekstrak rimpang temulawak

(Curcuma zanthorrhiza Roxb.)

73,60 % Setianingsih, 2011 6 Ekstrak metanol Kulit Buah

Manggis (Garcinia mangostana L.)

71,57 % Syajarwati, 2013 7 Ekstrak Biji Jinten Hitam (Nigella

sativa L.)

64,454 % A’yuni, 2013

2.5 SDS PAGE

Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) adalah metode pemisahan protein dalam sampel untuk dianalisa dan ditentukan berat molekulnya. Protein-protein akan terdenaturasi dan melepas monomernya karena pemanasan yang ditunjukkan dengan adanya agen-agen pereduksi (2-merkaptoetanol atau ditiotheitol) dan surfaktan bermuatan negatif (Sharma, 2009).

Elektroforesis gel Sodium Dodesil Silfat (SDS) poliakrilamid adalah teknik yang sering digunakan dalam bidang biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau molekul). Sampel elektroforesis gel SDS dan sampel elektroforesis tersebut di pisahkan berdasarkan ukuran berat molekul (Gam & Latiff, 2005).

Medan listrik yang digunakan menyebabkan protein bermuatan negatif bermigrasi menuju anoda. Setiap protein akan bergerak melalui matriks gel. Protein yang berbobot molekul kecil akan lebih mudah melalui pori-pori pada gel, sedangkan protein yang berbobot molekul lebih besar akan memiliki lebih banyak kesulitan untuk melewati pori-pori tersebut. Setelah waktu yang telah ditentukan protein akan bermigrasi berdasarkan ukuran; protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauh di bawah gel,

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sedangkan yang lebih besar akan tetap lebih dekat ke titik asal. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekul (Gam & Latiff, 2005).

Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu Coomassie Brilliant Blue dan pewarna perak. Pewarna Coomassie Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi sebuah band 50 ng protein. Pewarnaan perak dapat meningkatkan sensitivitas pewarnaan biasanya 50 kali. Banyak variabel yang dapat mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein memiliki karakteristik pewarnaan sendiri (Jovanovic et al, 2007).

2.6 Kolorimetri ATPase

Uji kolorimetrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang tidak menyerap cahaya. Adapun pereaksi yang digunakan adalah pereaksi yang bewarna seperti malakit hijau dan amonium molibdat. Uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan warna yang terjadi dari suatu zat yang tidak bewarna dengan suatu pereaksi warna ( Utama et al, 2000).

2.7 Prinsip Kromatografi (Yazid, 2005)

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase gerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase gerak dapat berupa zat cair atau gas.

Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari berbagai macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam sistem yang terdiri dari fase diam dan fase gerak. Semua pemisahan pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing komponen diantara kedua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan (mobilitas) antara komponen yang satu dengan lainnya disebabkan oleh perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan atau penguapan diantara kedua fase.

Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar, maka akan terjadi pemisahan secara sempurna. Oleh karena itu dalam kromatografi, pemilihan terhadap fase gerak maupun fase diam perlu dilakukan sedemikian rupa sehingga semua komponen bisa bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda agar dapat terjadi proses pemisahan.

2.8 Kolom Kromatografi (Gritter et al, 1991)

Kolom kromatografi merupakan cara yang paling lama dari kromatografi yang ada. Fase diam, baik bahan penjerap atau film zat cair pada penyangga, ditempatkan didalam tabung kaca berbentuk silinder, pada bagian bawah tertutup dengan katup atau keran, dan fase gerak dibiarkan mengalir ke bawah melaluinya karena gaya berat.

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi yang keluar dari atas kolom.

Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut.

15

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3

METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai bulan Agustus 2013. Pembuatan ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, dan laboratorium Kimia Obat FKIK Jurusan Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Uji aktivitas inhibisi enzim RNA helikase virus HCV dilakukan di Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong, Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) adalah pisau, kertas polos, maserator, batang pengaduk, gelas ukur (Duran), kertas saring, kapas, lumpang alu, tabung reaksi, corong buchner, cawan penguap, timbangan analitik, alat penggiling simplisia, dan rotary evaporator (Eyela).

Alat-alat yang digunakan untuk ekspresi, pemurnian dan pengujian aktivitas RNA helikase HCV adalah inkubator goyang (N-Biotek), vortex, tabung sentrifus 50 ml dengan penutup (Falcon), tabung sentrifus 1,5 ml (Eppendorf), erlenmeyer (Pyrex), 96-well microtiter plate (Polycarp), pipet mikro (Gilson), neraca analitik (Acis), peralatan gelas, microplate reader (Multiscan EX Thermo), vial, Laminar Air Flow (ESCO), lemari pendingin (Sansio), sonikator (Labsonic), autoklaf tipe vertikal (mode TA-630), sentrifus (HERMLE), hot plate magnetic stirer (Cimarec), SDS-PAGE (ATTO).

Alat-alat yang digunakan untuk pemisahan tahap awal senyawa inhibitor RNA helikase HCV adalah kolom kromatografi, erlenmeyer, beaker gelas, lempeng KLT, chamber, vial, lampu UV.

Sampel yang digunakan adalah kulit buah manggis. Buah manggis diperoleh dari daerah Kampung Cengal, Desa Karacak, Kec. Leuwiliang, Kab. Bogor dan telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense Litbang LIPI Cibinong, Bogor.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan skrinning fitokimia kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) adalah pelarut metanol absolut 96%, aquadest, NaOH, dragendroff’s, mayer’s, asam hidroklorit, ferri klorida, asam sulfat, dan kloroform.

Bahan-bahan yang digunakan untuk ekspresi, pemurnian, dan pengujian inhibisi RNA helikase HCV adalah bakteri Escerichia coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid 21b (koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), media Luria Bertani (LB), aquades, ampisilin, IPTG (isopropil β-D-thiogalaktopiranoside), dapar B (10 mM Tris HCl pH 8.5, 100 mM NaCl, dan 0,25% Tween 20), resin Talon, dan dapar elusi (400 mM imidazole dalam buffer B), 0.1 mM ATP (Adenosin trifosfat), 0.1 mM MOPS (asam 4-morfolinopropana sulfonat), 1 mM MgCl2, larutan hijau malakit, 2.3 % polivinil alkohol, amonium molibdat, natrium sitrat, sukrosa, TEMED, akrilamid, amonium persulfat, coomassie brilliant blue, dan marker protein 250 kDa untuk analisis bobot molekul RNA helikase.

Bahan-bahan yang digunakan untuk pemisahan tahap awal senyawa inhibitor RNA helikase HCV adalah ekstrak kental kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.), silika gel, kloroform, methanol, kapas, alumunium foil, dan kertas saring.

3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel

Sampel buah manggis sebanyak 5 kg diperoleh dari kampung cengal, desa karacak, kecamatan Leuwiliang, kabupaten Bogor padabulan Februari. Bagian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah (pericarp) manggis.

3.3.2 Determinasi Sampel

Determinasi buah manggis (Garcinia mangostana L.) dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.3.3 Persiapan Simplisia

Kulit buah manggis sebanyak 2,5 kg yang telah dipisahkan dari daging buahnya dibersihkan dari kotoran dengan menggunakan air mengalir (sortasi basah), kemudian dirajang dengan menggunakan pisau menjadi ukuran yang lebih kecil ± 3 cm. Rajangan kulit buah manggis ini kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan (pemanasan tidak langsung). Kulit buah manggis kering kemudian digiling dengan menggunakan alat penggiling dan diayak dengan ayakan 40 mesh sehingga didapat serbuk kulit buah manggis kering sebanyak 800 g.

3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 300 g dimasukkan kedalam maserator kemudian dimaserasi dengan menggunakan pelarut metanol 96% sebanyak 900 ml. Proses maserasi didiamkan selama 24 jam, sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung didalam erlenmeyer dengan cara disaring menggunakan corong buchner dan kertas saring. Kemudian ampas dimasukkan ke dalam maserator, untuk dimaserasi kembali. Proses maserasi ini dilakukan selama 3 x 24 jam. Seluruh hasil penampungan pelarut dicampur untuk kemudian dilakukan proses pemekatan ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator suhu 45⁰C. Dan selanjutnya diperoleh ekstrak kental kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) sebanyak 70,2984 g.

3.3.5 Rendemen Total Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Rendemen ektrak kulit buah manggis total dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir ekstrak kulit buah manggis total yang diperoleh.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.3.6 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia ini dilakukan untuk melihat kandungan golongan senyawa yang terdapat didalam ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.).

a. Alkaloid

Ekstrak dilarutkan dalam pelarut asam hidroklorit dan kemudian disaring. Dilakukan uji pada beberapa pereaksi.

1. Test Mayer’s: filtrat ditambahkan dengan pereaksi Mayer’s (kalium merkuri iodida). Maka akan terbentuk endapan berwarna kuning yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid.

2. Test Dragendroff’s: filtrat ditambahkan pereaksi dragendroff’s (larutan potassium iodida). Maka akan membentuk endapan merah yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid (Tiwari, P et al, 2011).

b. Saponin

Test busa: 0,5 mg ekstrak dikocok dalam 2 ml aquades. Jika terbentuk busa yang cukup lama ± 10 menit menunjukkan adanya senyawa saponin (Tiwari, P et al, 2011).

c. Fenol

Test ferric chlorida: ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan ferri klorida. Terbentuk warna hitam kebiru-biruan menunjukkan adanya senyawa fenol (Tiwari, P et al, 2011).

d. Tannin

Ekstrak sebanyak 0,5 gram dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan beberapa tetes ferri klorida 0,1 %. Terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman menunjukkan keberadaan tannin (Ayoola, G.A. et al., 2008).

e. Flavonoid

Larutan ammonia sebanyak 5 ml ditambahkan kedalam filtrat air dari ekstrak, lalu ditambahkan 1 ml asam sulfat. Terbentuk warna kuning menunjukkan adanya flavonoid (Ayoola, G.A. et al, 2008).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta f. Terpenoid (Uji Salkowski)

Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 2 ml kloroform, kemudian ditambahkan 3 ml asam sulfat (H2SO4) untuk membentuk lapisan. Adanya warna merah kecoklatan diantara lapisan menunjukkan adanya senyawa terpenoid (Ayoola, G.A. et al, 2008).

3.3.7 Parameter dan Metode Uji Ekstrak 3.3.7.1Parameter Non Spesifik

a. Susut Pengeringan

Ekstrak ditimbang sebanyak 1,673 g dan dimasukkan kedalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105⁰C _{selama 30 menit dan ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan} dalam botol timbang, dengan cara menggoyangkan botol, hingga membentuk lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika berupa ekstrak kental diratakan dengan batang pengaduk. Kemudian dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105⁰C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Depkes, 2000).

b. Kadar Abu

Untuk penentuan kadar abu, ekstrak sebanyak 1,008 g dipanaskan pada temperatur 625⁰C di mana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera dalam monografi (Depkes RI, 2000).

3.3.7.2Parameter Spesifik a. Parameter Identitas Ekstrak

Memberikan identitas obyektif dari nama dan spesifik dari senyawa identitas. Meliputi :

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta I.Deskripsi tata nama :

1. Nama Ekstrak (generik, dagang, paten) 2. Nama lain tumbuhan (sistematika botani) 3. Bagian tumbuhan yang digunakan

4. Nama indonesia tumbuhan

II.Ekstrak dapat mempunyai senyawa identitas, artinya senyawa tertentu yang menjadi petunjuk spesifik dengan metode tertentu (Depkes, 2000). b. Parameter Organoleptik Ekstrak

1. Bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair. 2. Warna : kuning, coklat, dll.

3. Bau : aromatik, tidak berbau, dll. 4. Rasa : pahit, manis, kelat, dll.

3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C (Utama et al, 2000) Produksi enzim RNA helikase virus hepatitis C dilakukan berdasarkan metode Utama et al, (2000). Sebelum melakukan ekspresi dilakukan pembuatan media LB (Luria Bertani) cair untuk Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS. Media LB dibuat sebanyak 10 ml untuk prekultur dan 400 ml untuk kultur. Pembuatan media LB 410 ml dengan cara mencampurkan tryptone 4.1 g, NaCl 4.1 g, yeast ekstrak 2.05 g dalam 410 ml aquades. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121⁰C selama 15 menit.

Langkah pertama ekspresi dan purifikasi RNA helikase virus hepatitis C adalah prekultur, media LB 10 ml diberi ampisilin 10 µl/ml dan dimasukkan bakteri E.coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen RNA helikase dihomogenkan dan diinkubasi dengan inkubasi goyang suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm dibiarkan selama satu malam.

Langkah kedua adalah kultur, hasil prekultur diinolukasikan kedalam media LB 400 ml yang telah diberi ampisilin 410 µl Dan diinkubasi dengan inkubator goyang suhu 37⁰C, 150 rpm selama satu jam. Kemudian ditambahkan IPTG (isopropil β-D-tiogalaktopiranoside) 0,3 mM 205 µl.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Dan diinkubasi kembali dengan inkubator goyang selama 3 jam pada suhu 37⁰C 150 rpm.

Selanjutnya hasil kultur dipindahkan dalam tube 50 ml vortex terlebih dahulu kemudian di sentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Endapan dicuci dengan media LB dan disentrifus kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan diperoleh pelet simpan pada suhu -20⁰C selama satu malam.

Proses selanjutnya adalah purifikasi, pelet yang diperoleh dilakukan freeze thawing atau pengeringbekuan sebanyak tiga kali. Setelah itu dilakukan sonikasi (pemecahan sel dengan menggunakan sonikator) amplitudo 40 cycle 0,5 selama 15 detik, dilakukan tiga kali dengan interval 1 menit. Selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 7000 rpm selama 20 menit. Supernatan dipindahkan dalam tube 50 ml dan pelet disimpan pada suhu -20⁰C. Sedangkan supernatan ditambahkan resin TALON 200 µl kemudian diletakkan pada rotary cold room selama 3 jam. Supernatan disentrifus selama 7 menit kecepatan 3500 rpm.

Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 10 ml dapar B diaduk secara perlahan dan disentrifus kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan dibuang kembali, pelet ditambahkan 10 ml dapar B dan disentrifus kembali selama 3 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan dibuang kembali, pelet diaduk perlahan dipindahkan dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan 100 µl dapar elusi dan diletakkan pada rotary cold room selama satu malam. Kemudian disentrifus kembali selama 1 menit, 3500 rpm. Endapan dicuci dengan 100 µl larutan dapar elusi dan diletakkan pada rotary cold room selama satu jam. Kemudian disentrifus kembali selama 1 menit, 3500 rpm. Setelah itu larutan (enzim) dan resin dipisahkan dan disimpan pada suhu 4⁰C.

3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Semua alat disiapkan, plat kaca yang digunakan terdiri atas short plate dan spacer plate dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Short plate ditempatkan pada bagian depan kaca spacer yang sebelumnya diberi casting frame pada bagian tengah dan dikunci dengan menggunakan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta casting stand. Selanjutnya dibuat larutan separating gel 8% (lampiran 8a). Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate sampai terisi dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan aquades hingga penuh. Ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit.

Setelah terbentuk gel dibuat larutan gel stacking 8% (lampiran 8b). Aquades pada separating dibuang dan dimasukkan larutan stacking pada sepertiga bagian celah. Dan dipasangkan comb, tunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit. Gel dipindahkan dari casting frame, gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, dan ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan larutan dapar elektroforesis SDS 1x pH 8,3.

Sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase HCV ditampung dalam tube 1,5 ml meliputi pelet, supernatan, inner volum, washing, elusi enzim dan resin. Masing-masing sampel yang diambil 20 µl dan ditambahkan 10 µl loading dye (lampiran 8c) kemudian dilakukan denaturasi yaitu dipanaskan didalam waterbath pada suhu 90⁰C selama 15 menit.

Masing-masing sampel tersebut dimasukkan kedalam well sebanyak 15 µl. Marker protein (BIORAD®) sebanyak 4 µl/gel dimasukan ke dalam well. Kemudian gel di elektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining comassie blue G-250 (lampiran 8d) selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker. Kemudian gel dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining (lampiran 8e) ± 30 menit, dan dibilas dengan aquades hingga bau asam hilang, diletakkan didalam kertas mika kemudian di scan.

3.3.10 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C (Utama et al, 2000)

Uji aktivitas enzim helikase berdasarkan metode ATPase kolorimetri. Langkah pertama dibuat pengenceran enzim 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x,

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pengenceran yang dilakukan menggunakan MOPS 10 mM. Kemudian pembuatan larutan master mix yang terdiri dari ddH2O, MOPS 0.1 M, MgCl2 0.1 mM, dan ATP 0.1 mM. Selanjutnya dilakukan pengujian dengan cara mengisi tiap microtiter plate 96-well dengan 5 µl pengenceran enzim dan 45 µl master mix. Untuk blanko, diisi 5 µl aquades dan 45 µl master mix. Semua pengujian dilakukan secara triplo.

Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Setelah pada menit ke-35 dibuat larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 % malakit hijau, H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan (2:2:1:1). Setelah masa inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan dalam tiap well sebanyak 100 µl, dan kemudian dilakukan inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Setelah masa inkubasi selesai ditambahkan 25 µl Na sitrat untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Selanjutnya hasil reaksi diukur dengan menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm.

3.3.11 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom Kromatografi

Pemisahan tahap awal ekstrak kental kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) menggunakan kolom kromatografi dengan diameter 2,54 cm dan panjang kolom 65 cm. Kolom kromatografi yang telah dibersihkan, disiapkan dengan memberi kapas pada ujung kolom untuk menahan silika gel agar tidak keluar, dipasang tegak lurus pada statif. Selanjutnya silika gel ditimbang sebanyak 100 g, dilarutkan dengan pelarut organik nonpolar (kloroform) hingga diperoleh silika dengan konsentrasi seperti bubur, diaduk hingga terbentuk suspensi.

Bubur silika dimasukkan kedalam kolom sambil diketuk-ketuk agar silika memadat didalam kolom serta dialiri pelarut kloroform didalam kolom, pelarut ditampung dan dimasukkan kembali. Dilakukan secara berulang-ulang sehingga silika gel menjadi padat didalam kolom. Ekstrak metanol kulit buah manggis sebanyak 4 g dilarutkan dengan pelarut metanol

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sebanyak 4 ml. Selanjutnya dimasukkan secara hati-hati kedalam kolom pada bagian atas dengan cara dialirkan melalui dinding kolom.

Pemisahan ekstrak metanol kulit buah manggis dengan menggunakan pelarut gradien kloroform-metanol dengan perbandingan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9). Sebanyak 4 ml eluat ditampung didalam masing-masing vial. Masing-masing-masing fraksi diuapkan dari eluennya untuk kemudian diuji aktivitas inhibisi RNA helikase virus hepatitis C dengan menggunakan uji ATPase kolorimetri (Mustopa et al, 2012).

3.3.12 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV (Utama et al, 2000)

Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap enzim RNA Helikase virus HCV dilakukan berdasarkan metode ATPase kolorimetri. Fraksi-fraksi yang diperoleh dari hasil pemisahan dengan kolom kromatografi yang telah diuapkan, dibuat dalam larutan stok ditimbang sebanyak 0,025 g dilarutkan dengan metanol sebanyak 1 ml. Untuk uji aktivitas diambil sebanyak 5 µl dan dilarutkan dengan larutan master mix sebanyak 45 µl sehingga konsentrasi sampel yang diuji sebesar 2.500 ppm.

Pada pengukuran absorbansi enzim RNA Helikase dilakukan dengan menambahkan 5 µl ekstrak kulit buah manggis hasil pemisahan pada setiap well dan 45 µl campuran larutan master mix dan pengenceran enzim. Untuk blanko dimasukkan 5 µl aquades dan 45 µl larutan master mix. Untuk kontrol positif berupa campuran larutan master mix dan pengenceran enzim 50 µl, sedangkan kontrol negatif berupa campuran 5 µl metanol dan 45 µl campuran master mix dan pengenceran enzim. Semua pengujian dilakukan secara triplo.

Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Setelah pada menit ke-35 dibuat larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 % malakit hijau, H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah masa inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan dalam tiap well sebanyak 100 µl, dan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kemudian dilakukan inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Setelah masa inkubasi selesai ditambahkan 25 µl Na sitrat untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Selanjutnya hasil reaksi diukur absorbansinya menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm.

Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung persentase penghambatan ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap RNA Helikase HCV. Perhitungan persen penghambatan sampel ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase berdasarkan perhitungan :

% inhibisi = Di mana :

A = serapan enzim RNA helikase tanpa adanya senyawa inhibitor. I = serapan enzim RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor.

3.3.13 Visualisasi Hasil Fraksi Kolom Kromatografi dengan Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis

Fraksi hasil pemisahan kolom kromatografi dilihat pola kromatogramnya dengan menggunakan kromatografi lapis tipis fase diam silika gel GF254. Eluen yang digunakan adalah kloroform 100 % dimasukkan kedalam chamber, masing-masing fraksi dototolkan pada plat silika kemudian di elusi pada eluennya. Hasil pemisahan dengan KLT dilihat dbawah UV pada panjang gelombang 254 nm.

3.3.14 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C

Fraksi dari hasil kolom kromatografi yang memberikan aktivitas inhibisi terhadap RNA helikase virus hepatitis C selanjutnya dihitung aktivitas RNA helikase dengan menentukan kadar fosfat yang dilepaskan. Fosfat bebas yang dilepaskan berasal dari hasil reaksi antara enzim RNA helikase dan ATP (Utama et al, 2000). Kadar fosfat yang dilepaskan berbanding lurus dengan aktivitas enzim RNA helikase, namun berbanding terbalik dengan aktivitas penghambatan senyawa inhibitor enzim RNA helikase.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Perhitungan kadar fosfat dilakukan dengan menggunakan kurva kalibrasi dari K2HPO4. Di mana K2HPO4 dibuat dalam larutan dengan konsentrasi 0,1 mM, 0,2 mM, 0,4 mM, 0,6 mM, 0,8 mM dan 1 mM (Lampiran 16). Hasil pembacaan absorbansi selisih panjang gelombang 620 nm dan 450 nm dengan menggunakan microplate reader, dimasukkan kedalam persamaan kurva kalibrasi K2HPO4.

27

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Determinasi sampel

Sampel buah manggis yang diperoleh dari kampung cengal, desa karacak, kecamatan leuwiliang, kabupaten Bogor dideterminasi di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi menyatakan bahwa sampel merupakan jenis Garcinia mangostana L. suku Clusiaceae (Lampiran 1).

4.2 Rendemen Ekstrak

Metode ekstraksi yang dilakukan adalah dengan cara maserasi. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruang (Depkes, 2000). Ekstraksi dengan cara maserasi ini biasanya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan (Tiwari, P et al, 2011).

Maserasi yang dilakukan terhadap kulit buah manggis menggunakan pelarut metanol 96%. Hal ini bertujuan untuk menarik senyawa-senyawa polar yang terkandung dalam simplisia kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.). Merujuk dari penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Syajarwati (2013) bahwa aktivitas inhibisi tertinggi terhadap enzim RNA helikase HCV dari ekstrak kulit buah manggis pada ekstrak metanol dengan aktivitas penghambatan tertinggi sebesar 71,57 %.

Dari hasil maserasi diperoleh rendemen ekstrak sebesar 23,4348%. Nilai tersebut menyatakan bahwa ekstrak yang diperoleh cukup banyak, hal ini disebabkan karena pelarut metanol adalah pelarut universal yang mampu menarik banyak senyawa polar (Tiwari, 2011). Prinsip pelarutan yang dipakai pada metode ini adalah like dissolve like, di mana senyawa yang bersifat polar akan terlarut dalam pelarut polar dan senyawa yang bersifat kurang polar akan terlarut dalam pelarut kurang polar (Mutaqin et al, 2013).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.3 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia yang lakukan terhadap ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) bertujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang terdapat didalam ekstrak kulit buah manggis pada pelarut metanol. Pada kulit buah manggis kaya akan metabolit sekunder seperti tannin, terpenoid, alkaloid dan flavonoid yang dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri (Geetha R.V et al, 2011). Skrining fitokimia pada simplisia kulit buah manggis dan ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung senyawa kimia golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tanin dan steroid/triterpenoid (Pasaribu et al, 2012)

Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis

Ekstrak Metanol Keterangan

Alkaloid +

Flavonoid +

Saponin +

Tannin +

Fenol +

Terpenoid +

Dari identifikasi senyawa alkaloid ekstrak metanol kulit buah manggis memberikan hasil yang positif hal ini dikarenakan adanya endapan merah bata pada ekstrak dengan penambahan pereaksi Dragendorff, begitu pula dengan penambahan pereaksi Mayer menghasilkan endapan kuning. Alkaloid merupakan bahan alam heterosiklik yang mengandung nitrogen. Sebagai suatu golongan, alkaloid menunjukkan aktivitas biologis yang sangat luas dan juga tersebar luas, yang terdapat di tanaman, fungi, bakteri, amfibi, serangga, hewan laut dan manusia (Heinrich, 2009).

Pada identifikasi senyawa flavonoid memberikan hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada ekstrak dengan penambahan larutan ammonia dan asam sulfat. Flavonoid merupakan golongan senyawa terbesar dari senyawa fenol, flavonoid umumnya terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang mana pun mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida (Harborne, 1987).

Senyawa glikosida triterpen tersebar luas dalam tanaman dan kadang disebut saponin karena sifatnya mirip sabun dan mudah membentuk busa (Heinrich, 2009). Saponin merupakan senyawa yang bersifat seperti sabun, serta dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel darah (Harborne, 1987). Pada identifikasi senyawa saponin memberikan hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya busa yang stabil setelah dikocok selama ± 10 menit dengan penambahan aquades. Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengekstraksi tumbuhan atau waktu memekatkan ekstrak tumbuhan merupakan bukti terpercaya akan adanya saponin (Harborne, 1987).

Pada identifikasi senyawa tanin memberikan hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya warna biru kehitaman dengan penambahan ferri klorida pada ekstrak yang dilarutkan dengan aquades. Senyawa tanin adalah golongan bahan alam yang memberikan rasa kesat dan pahit dalam tanaman dan makanan. Golongan ini terdiri atas senyawa polifenol larut air yang dapat memiliki bobot molekul tinggi. Sifat utama tanin adalah kemampuannya berikatan dengan protein (Heinrich, 2009).

Selanjutnya identifikasi senyawa fenol memberikan hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya warna hitam kebiru-biruan pada ekstrak dengan penambahan ferri klorida. Senyawa fenol yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua penyulih hidroksil. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya mereka sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida. Cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah dengan menambahkan larutan besi (III) klorida 1% dalam air atau etanol kepada larutan cuplikan, yang menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru atau hitam yang kuat (Harborne, 1987).

Senyawa terpen tersebar luas di alam dan terdapat dalam banyak spesies, termasuk pada manusia. Senyawa ini kadang-kadang disebut isoprena karena motif berulang yang banyak dijumpai dalam strukturnya (unit C5 berulang bercabang, rangka isopentana) mirip dengan isoprena

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta (Heinrich, 2009). Pada identifikasi senyawa terpenoid memberikan hasil yang positif ditandai dengan adanya warna merah kecoklatan diantara lapisan kloroform dan asam sulfat yang ditambahkan kedalam ekstrak. 4.4 Parameter dan Metode Uji Ekstrak

Parameter dan metode uji ekstrak yang dilakukan terhadap ekstrak kulit buah manggis dapat dilihat dari tabel 4.2.

Tabel 4.2 Parameter dan Metode Uji Ekstrak

Parameter Uji Ekstrak Ekstrak Metanol Menurut Literatur Parameter Non spesifik :

a. Susut pengeringan b. Kadar abu

Parameter Spesifik :

a. Parameter Identitas Ekstrak - Nama lain Tumbuhan

- Bagian yang digunakan - Nama Indonesia

tumbuhan b. Organoleptik - Bentuk - Warna 18,41 % 1,388 %

Mangi, manggi,

manggus, manggista Kulit Buah (pericarp) Manggis

Ekstrak kental Coklat

< 4 % (MMI jilid V, 1989)

Parameter uji ekstrak meliputi dua aspek: 1) aspek parameter spesifik yang berfokus pada senyawa atau golongan senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas farmakologis. 2) aspek parameter non spesifik yang berfokus pada aspek kimia, mikrobiologi dan fisis yang akan mempengaruhi keamanan konsumen dan stabilitas misal kadar logam, aflatoksin, kadar air, dan lain-lain (Saifudin, 2011).

Pada pengujian kadar abu dimaksudkan untuk menentukan karakteristik sisa kadar abu nonorganik setelah pengabuan. Pada prinsipnya dengan memanaskan ekstrak pada temperatur di mana senyawa organik dan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta turunannya terdestruksi dan menguap, sehingga hanya ada sisa kadar abu nonorganik. Nilai kadar abu yang diperoleh adalah 1,388 %, persyaratan batas kadar abu untuk ekstrak buah manggis pada buku Materia Medika jilid V adalah tidak lebih dari 4 %. Hal ini menandakan bahwa ekstrak memenuhi persyaratan kadar abu yang dianjurkan.

Pada uji parameter susut pengeringan untuk memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Nilai susut pengeringan yang diperoleh adalah 18,41 %. Hal ini menandakan tingginya kadar senyawa yang hilang selama proses pengeringan baik berupa air, sisa pelarut dan senyawa yang mudah menguap lainnya.

4.5 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Pada penelitian ini produksi enzim RNA helikase dilakukan untuk mendapatkan enzim RNA helikase virus hepatitis C yang dihasilkan oleh bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Dan kemudian akan digunakan untuk menguji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C.

Ekspresi RNA helikase virus hepatitis C dimulai dengan tahapan pre kultur yang dilakukan dalam media cair Luria Bertani (LB) yang merupakan media kompleks yang terdiri dari tripton, ekstrak khamir, dan natrium klorida dan merupakan media yang cocok untuk pertumbuhan bakteri. Ampisilin yang ditambahkan pada media LB berfungsi sebagai penghambat bagi pertumbuhan bakteri lain sehingga hanya bakteri Escherichia coli yang membawa gen RNA helikase virus hepatitis C yang dapat tumbuh pada media tersebut.

Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm selama semalam, kondisi ini merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri (Pelzar & Chan, 1986). Selanjutnya hasil prekultur dipindahkan ke medium LB 400 ml yang sebelumnya telah ditambahkan ampisilin dan diinkubasi kembali pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm hingga diperoleh nilai OD600 (Optical Density) mencapai

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 0,3 atau pada saat bakteri mencapai fase logaritmik, karena fase ini merupakan fase awal di mana bakteri Escherichia coli tumbuh. Kultur ditambahkan IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase) yang bertujuan untuk menginduksi gen RNA helikase virus hepatitis C agar terjadi ekspresi berlebih. Sehingga dihasilkan jumlah enzim RNA helikase yang lebih besar hingga fase awal stasioner di mana nilai OD600 mencapai 1 (Utama et al, 2000).

Pengumpulan pelet bakteri E. coli dengan cara disentrifugasi pada suhu 4⁰C dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit untuk memisahkan sel E. coli dengan media LB. Pelet yang telah terkumpul disimpan pada suhu -20⁰C untuk menjaga stabilitas RNA helikase HCV. Proses selanjutnya adalah purifikasi enzim RNA helikase virus hepatitis C yang bertujuan untuk memurnikan hasil ekspresi protein RNA HCV yang telah disisipkan dalam bakteri E. coli BL 21 (DE3) pLysS.

Proses purifikasi diawali dengan pemecahan sel yang terdiri atas dua metode yaitu pengeringbekuan dan sonikasi. Proses pengeringbekuan dan sonikasi dalam purifikasi RNA helikase bertujuan untuk memecah sel bakteri rekombinan karena RNA helikase bersifat intraseluler. Pengeringbekuan dilakukan dengan menempatkan sel secara bergantian pada suhu -20⁰C dan suhu ruang, masing-masing selama 30 menit sebanyak tiga kali pengulangan. Proses pengeringbekuan ini menyebabkan melunaknya dinding sel bakteri sehingga mempermudah proses pemecahan sel.

Metode berikutnya adalah sonikasi dengan menggunakan sonikator, enzim RNA helikase HCV disuspensikan terlebih dahulu dengan dapar B (10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris HCl berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA helikase sehingga stabilitasnya terjaga, natrium klorida berperan untuk menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik dengan RNA helikase (Vanz et al, 2008). Sedangkan tween 20 merupakan detergen non-ionik yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sel. Metode sonikasi ini akan merusak organel dalam sel namun tidak merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya.

Hasil sonikasi selanjutnya di sentrifugasi untuk memisahkan metabolit intraseluler dan ekstraseluler. Supernatan berupa metabolit intraseluler dimurnikan kembali dengan resin TALON dan dibiarkan selama 3 jam didalam cold rotary room, resin TALON akan mengikat RNA helikase, pengikatan dilakukan oleh logam Co2+ yang terdapat dalam resin TALON. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit.

Proses terakhir dari purifikasi adalah pencucian dengan menggunakan dapar B dan disentrifugasi kembali pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Pelet ditambahkan dapar elusi (imidazol dalam dapar B) untuk menghilangkan protein selain enzim RNA helikase. Imidazol yang terdapat dalam dapar elusi ini akan memutus ikatan antara RNA helikase dengan resin TALON dan selanjutnya disentrifugasi kembali. Sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit digunakan untuk memisahkan imidazol dengan enzim yang telah murni. Penggunaan kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001).

4.6 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Uji kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan menggunakan SDS PAGE dengan konsentrasi 8%. SDS PAGE merupakan teknik yang digunakan untuk menganalisis bobot molekul suatu protein. Adapun prinsip kerjanya adalah pemisahan berdasarkan migrasi protein pada media penyangga. Komposisi SDS PAGE adalah akrilamid, tris asam klorida, air suling, tetramethylethylendiamine dan amonium persulfat. Akrilamid berguna sebagai pembentuk gel, tris asam klorida berguna sebagai dapar atau pengatur keseimbangan pH. Amonium persulfat sebagai inisiator dalam

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta proses polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid, sedangkan tetramethylethylendiamine berguna sebagai katalisator reaksi polimerasi akrilamid menjadi akrilamid. Dan air suling sebagai pencuci pada proses pembuatan gel akrilamid.

Berdasarkan hasil SDS PAGE pada gambar 4.1 menunjukkan pita protein tunggal dengan bobot molekul 54 kDa. Sehingga dapat dikatakan enzim RNA helikase yang dipurifikasi telah murni sesuai dengan yang telah dilaporkan sebelumnya oleh Utama et al, 2000 yang menyatakan bahwa bobot molekul RNA helikase adalah sebesar 54 kDa. Pada lajur pelet tidak menunjukkan adanya pita protein dikarenakan metabolit intraseluler telah berada pada supenatan (S). Pada lajur inner volume (IV) dan supernatan (S) terdapat penumpukan pita protein dikarenakan masih banyak metabolit intraseluler yang belum termurnikan melalui tahap purifikasi. Lajur washing (W) yang merupakan hasil tahapan pencucian binding resin TALON dan tidak menunjukkan adanya pita protein yang berarti pada proses pencucian ini tidak terbawa protein RNA helikase. Adapun marker yang digunakan adalah marker BIORAD®.

Hasil SDS PAGE yang diperoleh belum terlalu bagus dikarenakan waktu pencelupan gel SDS PAGE didalam larutan destaining commassie blue terlalu cepat sehingga larutan commassie blue yang memberikan warna biru masih terlihat pada gel SDS PAGE.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 4.1. Hasil SDS PAGE RNA Helikase HCV

Keterangan : S= Supernatan, W1= Washing 1, IV= Inner Volume, M= Marker, E1= Elusi 1

4.7 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV

Setelah diperoleh enzim RNA helikase murni selanjutnya dilakukan uji aktivitas inhibisi ekstrak metanol kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV dengan menggunakan metode kolorimetri ATPase. Uji kolorimetri ATPase digunakan untuk menguji aktivitas enzim yang bergantung pada keberadaan ATP sebagai sumber energi dan melibatkan pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA helikase. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik).

Tahap awal dilakukan dengan mengencerkan ekstrak metanol kulit buah manggis dengan methanol absolut. Kemudian sampel ditambahkan pada setiap well sebanyak 5 µl yang sebelumnya telah terisi larutan master mix sebanyak 45 µl yang terdiri dari air suling, MOPS, MgCl2, dan ATP serta enzim RNA helikase yang telah diencerkan dengan aquades. ATP (adenosin

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta trifosfat) merupakan substrat pada pengujian ATPase kolorimetri, MOPS (asam 4-morfolinopropana sulfonat) berperan sebagai dapar dalam larutan master mix. MgCl2 berfungsi sebagai kofaktor RNA helikase, dan air suling sebagai pelarut (Utama et al, 2000).

Larutan pewarna yang ditambahkan pada reaksi ini merupakan indikator pada reaksi pengujian. Larutan pewarna malachite green terdiri dari ammonium molibdat yang berikatan dengan fosfat anorganik yang terhidrolisis menghasilkan kompleks fosfomolibdat dan malachite green. Semakin banyak jumlah kompleks fosfomolibdat dan malachite green, maka semakin pekat warna yang dihasilkan (hijau tua), begitu pula sebaliknya, Semakin sedikit jumlah kompleks fosfomolibdat dan malachite green, maka semakin encer warna yang dihasilkan (hijau muda).

Pada reaksi ini juga dibuat larutan blanko yaitu larutan master mix tanpa penambahan enzim RNA helikase sehingga tidak dihasilkan fosfat bebas yang menyebabkan tidak terbentuknya kompleks fosfomolibdat dan malachite green sehingga warna yang dihasilkan lebih muda. Uji aktivitas inhibisi secara kolorimetri dilakukan dengan mengukur panjang gelombang pada reaksi antara enzim RNA helikase dan ekstrak kulit buah manggis menggunakan microplate reader.

Absorbansi diukur pada dua panjang gelombang, yaitu panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 optimum untuk penyerapan warna kebiruan, sedangkan panjang gelombang 405 nm optimum untuk penyerapan warna kekuningan. Kedua panjang gelombang ini digunakan agar perhitungan reaksi antara RNA helikase dengan ATP lebih akurat. Perhitungan konsentrasi fosfat anorganik yang terinhibisi oleh sampel menggunakan perbandingan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986).

Reaksi warna di hentikan dengan penambahan natrium sitrat pada campuran reaksi. Natrium sitrat berfungsi mencegah terbentuknya reaksi enzimatis yang berlebihan.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 4.2. Kurva Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap

RNA Helikase HCV

Dari gambar diatas, menyatakan bahwa ekstrak metanol kulit buah manggis memiliki aktivitas yang masih rendah dalam menghambat enzim RNA helikase virus hepatitis C secara invitro menggunakan uji kolorimetri ATPase dengan persentase 66,28 % pada konsentrasi yang masih tinggi 5.000 ppm. Sedangkan pada konsentrasi 10.000 ppm tidak dapat dibaca pada uji kolorimetri ATPase dikarenakan masih menggumpal sehingga perlu dilakukan pengenceran.

Pelarut yang digunakan pada uji kolorimetri ATPase adalah metanol. Metanol secara kimia merupakan zat denaturan pada enzim, namun selama dalam konsentrasi kecil maka metanol tidak mengganggu kerja enzim helikase dalam menginhibisi virus. Metanol dikontrol dengan cara menjadikannya sebagai kontrol negatif, sehingga hasil akhir dari persen penghambatan dikurangi dengan kontrol negatif agar diperoleh nilai persen yang sesungguhnya dari senyawa inhibitor ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.).

4.8 Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV

Pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi merupakan pemisahan tahap awal terhadap senyawa yang terkandung pada ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.). Prinsip kerja pemisahan kolom

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 16. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase)

Data :

Grafik :

Konsentrasi K2HPO4 (mM)

Absorbasi 620 nm dengan referensi 405 nm 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.000 0.102 0.239 0.417 0.622 0.834 1.022

y = 1.020x + 0.010 R2 = 0.9989

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 17. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV

Diketahui : y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 14) Sampel didilusi 40x

OD pada 620 nm = 1,103 Masa inkubasi 45 menit

1 well terdapat 5 µ L enzim RNA helikase

Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL 1 pmol = 0,05

Ditanya : Aktivitas enzim RNA helikase Jawab : y = 1,020x + 0,010

1,103 = (1,020x) + 0,010 x = 1,0712 mM fosfat

Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,0712 mM fosfat x 40 = 4,28 x 10-5 mol fosfat/mL

Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit =

= 9,52 x 10-7 mol fosfat/mL/menit

Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µ L x 5 µL

= 91,6 µg = 1832 pmol protein

Aktivitas enzim RNA helikase =

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 18. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan

Penambahan Senyawa Inhibitor Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Ket % inhibisi Aktivitas RNA

helikase enzim

pengenceran 15x

0 519,768

kontrol (-) 1,239 513,4255

fraksi 1 57,721 217,0721

fraksi 2 53,581 238,7952

fraksi 3 41,221 303,6473

fraksi 4 16,485 433,4307

fraksi 5 79,631 102,1143

fraksi 6 55,364 229,44

fraksi 7 77,002 115,9092

fraksi 8 58,447 213,2666

fraksi 9 82,442 87,36796

fraksi 10 24,267 392,6008

fraksi 11 59,716 206,607

fraksi 12 7,404 481,0787

fraksi 13 10,638 464,1125

fraksi 14 13,962 446,6707

fraksi 15 11,363 460,307

fraksi 16 20,852 410,5184

fraksi 17 30,281 361,0469

fraksi 18 39,982 310,1483

fraksi 19 56,089 225,6345

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

fraksi 21 32,276 350,5818

fraksi 22 38,803 316,3323

fraksi 23 40,858 305,55

fraksi 24 46,238 277,3259

fraksi 25 41,886 300,1589

fraksi 26 37,171 324,8946

fraksi 27 31,973 352,1674

fraksi 28 37,836 321,4063

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 19. Gambar Dokumentasi dan Alat Penelitian

Alkaloid Flavonoid Saponin

Tanin Fenol Terpenoid

Susut Pengeringan Kadar Abu

Kolom Kromatografi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Microplate reader Rotary evaporator Inkubator goyang

Laminar Air Flow Sentrifus Hot Plate

Sonikator SDS-PAGE

96-well microtiter plate