Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Prosedur Kerja .1 Perbanyakan dan Pembuatan Suspensi

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai Agustus 2013 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah timbangan meja, cawan petri, erlenmeyer, autoklaf, inkubator bakteri, oven, kamera digital, mikroskop, spatula, propipet, bunsen, jarum ose, pipet serologi, hot plate, handspray, objek glass, cover glass, tabung reaksi, rak tabung, sentrifugasi, refegirator, gelas ukur, spektrofotometer, water bath, air laminar flow dan moisture balance. Bahan yang digunakan adalah talek, tapioka, kitosan, tepung jagung, akuades, spiritus, Media Plate Count Agar PCA, larutan Mac Farland, Phosphate Buffer Saline PBS, malachite green,safranin, aluminium foil, Media Garam Minimum Kitin MGMK, unsur mikro yaitu Fe, Mg, Mn, dan Zn pada konsentrasi 5 ppm, kitin 0,5 , ekstrak yeast 1 dan isolat bakteri kitinolitik koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara yaitu Bacillus sp. sebelumnya disebut isolat BK17 yang diisolasi dari tanah Bangka . 3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Perbanyakan dan Pembuatan Suspensi Bacillus sp. BK17 Isolat bakteri Bacillus sp. BK17 disubkultur dalam media MGMK Komposisi media MGMK padat dan cara pembuatannya pada Lampiran 1 halaman 29 kemudian diinkubasi pada suhu kamar dengan pH 6,5-7 selama ± 2 hari. Hasil subkultur biakan bakteri diambil dengan jarum ose dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml akuades steril. Suspensi bakteri divortex dan Universitas Sumatera Utara disamakan kekeruhannya dengan standart Mac Farland sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel 10 8 cfuml.

3.3.2 Pertumbuhan dan Sporulasi Bacillus sp. BK17

Isolat bakteri Bacillus sp. BK17ditumbuhkan pada media cair Komposisi media cair molase tripton dan cara pembuatannya pada Lampiran 2 halaman 30 yang mengandung sumber karbon dan nitrogen terbaik yaitu molase tripton. Bakteri ditumbuhkan selama tiga hari yang dishaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 28ºC belum dipublikasi: Rachmi, 2014. Untuk pembentukan spora belum dipublikasi: Annisa, 2014 dilakukan shock temperature dengan pemanasan suhu 70ºC selama 60 menit didalam water bath. Kepadatan spora dan sel dihitung dengan menggunakan spektrofotometer masing-masing dengan panjang gelombang 600 nm dan 660 nm Fachmiasari Sembiring, 2004.

3.3.3 Pemanenan Spora Bacillus sp. BK17

Pemanenan spora Bacillus sp. BK17 dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 3.000 rpm selama 20 menit. Endapan yang diperoleh dicuci sebanyak tiga kali secara serial dengan larutan Phosphate Buffer Saline PBS kemudian disentrifugasi kembali 3.000 rpm selama 20 menit, lalu supernatan dibuang. Pengujian dilakukan dengan tiga kali pengulangan. Endapan biomassa Lampiran 9. Gambar 9.1 halaman 37 yang telah dicuci larutan PBS sebanyak tiga kali kemudian diresuspensikan kembali dengan kekeruhan yang sama dengan standart Mac Farland yaitu 10 8 cfuml setelah itu dimasukkan ke dalam bahan pembawa.

3.3.4 Pencampuran Spora Bacillus sp. BK17 pada Berbagai Bahan

Pembawa Bahan pembawa yang digunakan dalam penelitian ini adalah talek, tapioka, kitosan, dan tepung jagung Lampiran 9 Gambar 9.3 halaman 37. Bahan pembawa ditambahkan unsur mikro seperti Fe, Mg, Mn, dan Zn pada konsentrasi 5 ppm, kitin 0,5 dan yeast ekstrak 1 Sulistiani 2009. Suspensi spora Bacillus sp. BK17 dicampurkan secara merata dengan perbandingan 10 ml suspensi spora standart Mac Farland 10 8 cfuml untuk setiap 50 g bahan pembawa. Campuran antara suspensi dengan bahan pembawa selanjutnya Universitas Sumatera Utara dikeringanginkan dengan cara menyebarkannya pada loyang alumunium foil dengan sesekali dibalik dengan menggunakan spatula untuk memastikan bahwa seluruh bagian dapat tercampur secara baik, proses ini dilakukan secara aseptis di dalam laminar air flow dengan suhu 28 º C. Pengeringan campuran suspensi spora dan bahan pembawa dilakukan hingga kadar air mencapai ±12, di dalam oven dengan suhu 60 º C selama ± 21 jam. Kadar air bahan pembawa diukur menggunakan moisture balance Lampiran 9 Gambar 9.2 halaman 37. Bahan pembawa selanjutnya disimpan dalam botol film dimana masing-masing botol dilapisi lakban hitam. Bahan pembawa yang disimpan pada suhu ruang, pada botol film ditambahkan silica gel dalam kemasan yang telah dilapisi kertas saring agar menjaga kelembaman tetap rendah Lampiran 9 Gambar 9.4 halaman 37. 3.4 Parameter Pengamatan 3.4.1 Pengamatan Spora