17
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan pada bulan September 2014- November 2014.
3.2 Bahan - Bahan 3.2.1 Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan teri tawar, ikan teri nasi, dan ikan teri toge yang diperoleh secara purposif di Pusat Pasar, Medan.
3.2.2 Pereaksi
Bahan - bahan yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas pro analisis keluaran E. Merck yaitu asam nitrat 65 bv, asam sulfat 96 bv, etanol 96
vv, larutan baku kalsium 1000 µgml, ammonium molibdat, asam askorbat, kalium dihidrogen fosfat, kalium antimonil tatrat, akuabides PT. Ikapharmindo
Putramas.
3.3 Alat- alat
Alat yang digunakan adalah alat - alat gelas Pyrex dan Oberoi, blender, botol kaca, hot plate, oven, kertas saring Whatman No. 42, krus porselen, neraca
analitik AND GF-200, spatula, spektrofotometer serapan atom Hitachi Z-2000 lengkap dengan lampu katoda kalsium dengan nyala udara-asetilen,
spektrofotometer UV-Visible Hitachi U-1800, dan tanur Stuart.
3.4 Identifikasi Sampel
Identifikasi sampel dilakukan oleh Dinas Kelautan dan Perikanan Kabupaten Aceh Selatan.
Universitas Sumatera Utara
18
3.5 Pembuatan Pereaksi 3.5.1 Larutan asam nitrat 1:1 vv
Sebanyak 500 ml larutan asam nitrat 65 diencerkan dengan 500 ml akuabides Isacc, 1990.
3.5.2 Larutan H
2
SO
4
5 N
Dipipet 70,0 ml H
2
SO
4
96 vv, dimasukkan perlahan-lahan melalui dinding ke dalam labu tentukur 500 ml yang telah berisi air suling setengahnya.
Dicukupkan volumenya dengan air hingga garis tanda Lancashire, 2011.
3.5.3 Larutan ammonium molibdat 4bv
Ditimbang seksama 20,0 g ammonium molibdat. Kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 500 ml, ditambah dengan air suling dan dicukupkan
volumenya dengan air suling hingga garis tanda Lancashire, 2011.
3.5.4 Larutan asam askorbat 0,1 N
Ditimbang seksama 8,8 g asam askorbat dan dilarutkan dalam labu tentukur 500 ml dengan air suling dan dicukupkan volumenya dengan air suling
hingga garis tanda Lancashire, 2011.
3.5.5 Larutan kalium antimonil tatrat 0,274 bv
Ditimbang seksama 0,274 g kalium antimonil tartat, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml ditambah dengan air suling hingga garis tanda Lancashire,
2011. 3.5.6 Larutan H
2
SO
4
1 N
Sebanyak 3 ml larutan asam sulfat 96 diencerkan dengan akuabides
hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara
19
3.5.7 Larutan pengembang warna fosfor
Dicampur 500 ml asam sulfat 5 N, 150 ml ammonium molibdat 4 bv, 300 ml asam askorbat 0,1 N dan 50 ml kalium antimonil tatrat 0,274 bv
Lancashire, 2011.
3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pengambilan sampel
Metode pengambilan sampel dilakukan dengan cara sampling purposive yang dikenal juga sebagai sampling pertimbangan dimana sampel ditentukan atas
dasar pertimbangan bahwa sampel yang diambil dapat mewakili populasi Budiarto, 2004.
3.6.2 Penyiapan sampel
Sebanyak 250 g masing-masing ikan teri toge, teri nasi, dan teri tawar dicuci bersih dengan air mengalir dan ditiriskan sampai air cuciannya kering.
Sampel kemudian dihaluskan dengan blender. Dikeringkan dalam oven sampai kering seperti semula.
3.6.3 Proses destruksi kering
Sampel yang telah dihaluskan dan dikeringkan dalam oven ditimbang seksama sebanyak 5 g dalam krus porselen, diarangkan di atas hot plate, lalu
diabukan dalam tanur dengan temperatur awal 100 dan perlahan - lahan temperatur dinaikkan hingga suhu 500 dengan interval 25 setiap 5 menit.
Setelah dilakukan pengabuan selama 60 jam, suhu tanur diturunkan, pada krus porselen dikeluarkan dan dibiarkan hingga dingin pada desikator. Abu
ditambahkan 5 ml asam nitrat 1:1, kemudian diuapkan pada hot plate sampai
kering. Krus porselen dimasukkan kembali ke dalam tanur dengan temperatur
Universitas Sumatera Utara
20
awal 100 dan perlahan - lahan temperatur dinaikkan hingga suhu 500 dengan interval 25 setiap 5 menit. Pengabuan dilakukan selama 1 jam dan dibiarkan
hingga dingin pada desikator Isacc, 1990.
3.6.4 Pembuatan larutan sampel
Sampel hasil destruksi dilarutkan dalam 5 ml asam nitrat 1:1, lalu dipindahkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dibilas krus porselen dengan 10 ml
akuabides sebanyak tiga kali dan dicukupkan dengan akuabides hingga garis tanda. Kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No. 42 dimana 5 ml
filtrat pertama dibuang untuk menjenuhkan kertas saring kemudian filtrat selanjutnya ditampung ke dalam botol Isacc, 1990.
3.7 Analisis Kualitatif 3.7.1 Kalsium
3.7.1.1 Uji kristal kalsium dengan larutan asam sulfat 1N
Larutan sampel hasil destruksi sebanyak 1 - 2 tetes diteteskan pada object glass kemudian ditetesi dengan larutan asam sulfat 1N dan etanol 96 vv akan
terbentuk endapan putih lalu diamati di bawah mikroskop. Jika terdapat kalsium akan terlihat kristal berbentuk jarum Svehla, 1990.
3.7.2 Fosfor 3.7.2.1 Analisis dengan pereaksi ammonium molibdat
Kedalam tabung reaksi dimasukan 5,0 ml sampel, ditambah pereaksi ammonium molibdat 4 bv ± 2 ml, dikocok lalu diamkan, maka akan terbentuk
endapan kuning Svehla, 1990.
Universitas Sumatera Utara
21
3.8 Analisis Kuantitatif 3.8.1 Kalsium
3.8.1.1 Pembuatan kurva kalibrasi kalsium
Larutan baku kalsium 1000 µgml sebanyak 0,5 ml dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml lalu diencerkan dengan akuabides hingga garis tanda. Dari
larutan tersebut 10 µgml dipipet masing-masing 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml dan 2,5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dan diencerkan dengan
akuabides hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,2 µgml; 0,4 µgml; 0,6 µgml; 0,8 µgml dan 1,0 µgml, lalu dilakukan pengukuran
pada panjang gelombang 422,7 nm dengan tipe nyala udara-asetilen.
3.8.1.2 Penetapan kadar kalsium dalam sampel teri tawar
Larutan sampel hasil destruksi dipipet sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan dengan akuabides hingga garis tanda.
Lalu dipipet 1 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml Faktor pengenceran = 5000 kali. Lalu diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer
serapan atom pada panjang gelombang 422,7 nm dengan tipe nyala udara-asetilen. Nilai absorbansi yang diperoleh harus berada dalam rentang kurva kalibrasi
larutan baku kalsium. Konsentrasi kalsium dalam sampel dihitung berdasarkan persamaan garis regresi dari kurva kalibrasi.
3.8.1.3 Penetapan kadar kalsium dalam sampel teri nasi
Larutan sampel hasil destruksi dipipet sebanyak 0,2 ml dimasukkan ke
dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan dengan akuabides hingga garis tanda
Faktor pengenceran = 500 kali. Lalu diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 422,7 nm dengan tipe
Universitas Sumatera Utara
22
nyala udara-asetilen. Nilai absorbansi yang diperoleh harus berada dalam rentang kurva kalibrasi larutan baku kalsium. Konsentrasi kalsium dalam sampel dihitung
berdasarkan persamaan garis regresi dari kurva kalibrasi.
3.8.1.4 Penetapan kadar kalsium dalam sampel teri toge
Larutan sampel hasil destruksi dipipet sebanyak 0,2 ml dimasukkan ke
dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan dengan akuabides hingga garis tanda
Faktor pengenceran = 500 kali. Lalu diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 422,7 nm dengan tipe
nyala udara-asetilen. Nilai absorbansi yang diperoleh harus berada dalam rentang kurva kalibrasi larutan baku kalsium. Konsentrasi kalsium dalam sampel dihitung
berdasarkan persamaan garis regresi dari kurva kalibrasi.
3.8.2 Fosfor 3.8.2.1 Pembuatan Larutan Induk Baku KH
2
PO
4
LIB I
Ditimbang 0,44 g KH
2
PO
4
yang telah dikeringkan di dalam oven dengan suhu 105
C selama 1 jam, kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 5,0 ml HNO
3
5 N, dikocok hingga larut, dicukupkan volumenya dengan akuabides hingga garis tanda. Diperoleh konsentrasi fosfor pada larutan
induk baku LIB I adalah 1000 µgml.
3.8.2.2 Pembuatan kurva serapan larutan KH
2
PO
4
Dipipet 0,5 ml dari LIB I, dimasukan kedalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan akuabidest sampai garis tanda 5 µgml. Di pipet 1 ml dari larutan
5 µgml di masukan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 5 ml akuabides dan ditambahkan 1 ml larutan pengembang fosfor, kocok. Diukur serapan pada
panjang gelombang maksimum 400-800 nm.
Universitas Sumatera Utara
23
3.8.2.3 Penentuan waktu kerja
Dipipet 0,5 ml dari LIB I, dimasukan kedalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan volumenya dengan akuabides hingga garis tanda 5 µgml. Dipipet 1
ml dari larutan tersebut, ditambahkan 5,0 ml akuabides dan 1,0 ml larutan pengembang warna fosfor, dikocok, dan kemudian didiamkan. Diukur serapan
pada panjang gelombang maksimum 710 nm mulai menit ke-10 hingga menit ke 60 dengan interval 1 menit.
3.8.2.4 Pembuatan kurva kalibrasi fosfor
Dipipet 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml dari LIB I, dimasukan kedalam labu tentukur 100 ml, kemudian dicukupkan volumenya sampai garis
tanda. Dipipet 1 ml larutan tersebut, ditambahkan 5,0 ml akuabides dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor, dikocok dan diamkan selama 49 menit. Dengan
konsentrasi larutan 0,1429 µgml; 0,2857 µgml; 0,4286 µgml; 0,5714 µgml; 0,7143 µgml. Kemudian diukur serapan pada panjang gelombang 710 nm pada
menit ke-49 menit dengan spektrofotometri sinar tampak.
3.8.2.5 Penetapan kadar fosfor dalam sampel teri tawar
Dipipet 0,2 ml larutan sampel, dimasukan kedalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan volume dengan akuabides hingga garis tanda. Dipipet 1,0 ml larutan
tersebut, dimasukan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 5,0 ml akuabides dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor, dikocok Faktor Pengenceran = 3500 kali.
Diamkan selama 49 menit. Diukur serapan pada panjang gelombang maksimum 710 nm. Pengukuran harus dilakukan dalam rentang waktu kerja yang telah di
peroleh.
Universitas Sumatera Utara
24
3.8.2.6 Penetapan kadar fosfor dalam sampel teri nasi
Dipipet 0,8 ml larutan sampel, dimasukan kedalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan volume dengan akuabides hingga garis tanda. Dipipet 1,0 ml larutan
tersebut, dimasukan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 5,0 ml akuabides dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor, dikocok Faktor Pengenceran = 875 kali.
Diamkan selama 49 menit. Diukur serapan pada panjang gelombang maksimum 710 nm. Pengukuran harus dilakukan dalam rentang waktu kerja yang telah di
peroleh.
3.8.2.7 Penetapan kadar fosfor dalam sampel teri toge
Dipipet 0,4 ml larutan sampel, dimasukan kedalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan volume dengan akuabides hingga garis tanda. Dipipet 1,0 ml larutan
tersebut, dimasukan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 5,0 ml akuabides dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor, dikocok Faktor Pengenceran = 1750 kali.
Diamkan selama 49 menit. Diukur serapan pada panjang gelombang maksimum 710 nm. Pengukuran harus dilakukan dalam rentang waktu kerja yang telah di
peroleh. Menurut Gandjar dan Rohman, 2007, kadar mineral dalam sampel dapat
dihitung dengan cara sebagai berikut:
g Sampel
Berat n
pengencera Faktor
x ml
Volume x
µgml i
Konsentras µgg
Logam Kadar
3.9 Analisis Data Secara Statistik 3.9.1 Penolakan hasil pengamatan
Kadar kalsium, dan fosfor yang diperoleh dari hasil pengukuran masing- masing larutan sampel dianalisis dengan metode standar deviasi. Menurut
Sudjana 2005, rumus standar deviasi adalah:
Universitas Sumatera Utara
25
SD =
1 -
n X
- Xi
2
Keterangan: Xi = Kadar sampel
X = Kadar rata-rata sampel
n = Jumlah perlakuan
Untuk mencari t hitung digunakan rumus: t
hitung
= n
SD X
Xi
dan untuk menentukan kadar mineral di dalam sampel dengan interval kepercayaan 99,
α = 0,01, dk = n-1, dapat digunakan rumus: Kadar mineral : µ
=
X
± t α2, dk x SD √n
Keterangan:
X = Kadar rata-rata sampel
SD = Standar Deviasi
dk = Derajat kebebasan dk = n-1
α = Interval kepercayaan
n = Jumlah perlakuan
Dari hasil pengujian dapat dilihat dengan jelas perbedaan kadar kalsium dan fosfor yang signifikan antar sampel. Oleh karena itu tidak dilakukan uji
statistik lebih lanjut.
3.10 Uji Validasi Metode Analisis 3.10.1 Penentuan batas deteksi dan batas kuantitasi
Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi
Universitas Sumatera Utara
26
merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama.
Menurut Harmita 2004, batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Simpangan Baku X
SY =
2
2
n Yi
Y
Batas deteksi LOD =
slope X
SY x
3
Batas kuantitasi LOQ =
slope X
SY x
10
3.10.2 Uji perolehan kembali recovery
Menurut Harmita, 2004, uji perolehan kembali atau recovery dapat dilakukan dengan metode penambahan larutan standar standard addition
method. Larutan baku yang ditambahkan untuk kalsium yaitu 13 ml larutan baku kalsium konsentrasi 1000 µgml untuk teri tawar, 3 ml larutan baku kalsium
konsentrasi 1000 µgml untuk teri nasi dan teri toge. Larutan baku yang ditambahkan untuk fosfor yaitu 7 ml larutan baku fosfor konsentrasi 1000 µgml
untuk teri tawar, 2 ml larutan baku fosfor konsentrasi 1000 µgml untuk teri nasi, dan 3 ml larutan baku fosfor konsentrasi 1000 µgml untuk teri toge.
Sampel ikan teri yang telah dihaluskan ditimbang secara seksama sebanyak 5 g di dalam krus porselen, lalu ditambahkan 13 ml larutan baku
kalsium konsentrasi 1000 µgml untuk teri tawar, 3 ml larutan baku kalsium konsentrasi 1000 µgml untuk teri nasi dan teri toge. Dan untuk fosfor
ditambahkan larutan baku fosfor konsentrasi 1000 µgml 7 ml untuk teri tawar, 2
Universitas Sumatera Utara
27
ml untuk teri nasi dan 3 ml untuk teri toge. Kemudian dilanjutkan dengan prosedur destruksi kering seperti yang telah dilakukan sebelumnya.
Menurut Harmita, 2004, persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus di bawah ini:
Perolehan Kembali= C
F
- C
A
x 100 Keterangan :
C
A
= Kadar logam dalam sampel sebelum penambahan baku mg100g C
F
= Kadar logam dalam sampel setelah penambahan baku mg100g C
A
= Kadar larutan baku yang ditambahkan mg100g
3.10.3 Simpangan baku relatif
Menurut Harmita, 2004, keseksamaan atau presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Keseksamaan atau presisi
merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang
homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan adanya keseksamaan metode yang dilakukan. Adapun rumus untuk menghitung
simpangan baku relatif adalah: RSD =
100
X SD
Keterangan :
X = Kadar rata-rata sampel
SD = Standar Deviasi
RSD = Relative Standard Deviation
C
A
Universitas Sumatera Utara
28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identifikasi Sampel
Hasil identifikasi sampel yang dilakukan oleh Dinas Kelautan dan Perikanan Kabupaten Aceh Selatan terhadap ikan teri adalah jenis Stolephorus
spp. suku Engraulidae. Hasil identifikasi sampel dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 40.
4.2 Analisis Kualitatif
Kategori