BAHAN DAN METODE
Penelitian berlangsung selama 28 bulan dimulai bulan Januari 2002. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Enzimatis Balai Penelitian
Bioteknologi Tanaman Pangan dan Industri, Laboratorium Bioproses Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen, dan Laboratorium Rekayasa Bioproses PP
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB. Bahan dan Alat
Media mikrobiologi yang digunakan adalah ekstrak khamir, polipepton, K
2
HPO
4
, MgSO
4
.7H
2
O, NaCl, NH
4
Cl, Na
2
HPO
4
, oat spelt xylan, bakto agar, nutrien broth
. Isolat bakteri Clostridium acetobutylicum ATCC 824 diperoleh dari Balitvet. Bahan kimia untuk ekstrak xilan yaitu natrium hipokhlorit, HCl, H
2
SO
4
, NaOH. Bahan kimia untuk karakterisasi enzim dan pemurnia n xilanase yaitu sodium
didosilsulfat, amonium persulfat,TEMED, tris-HCl, gliserol, albumin bovin serum, akrilamid, asam sitrat, bufer fosfat sitrat, bufer nitrat, maltosa, glukosa, ion- ion logam
dalam persenyawaan garamnya, aseton, etanol dan akuades. Tongkol jagung diperoleh dari petani.
Alat yang digunakan antara lain shaker, laminer, inkubator oven, inkubator shaker
, centrifuge, bioreaktor, spektrofotometer, preparative electrophoresis Prepcell 491 Biorad, pipet eppendorf, eppendorf tip, dan tabung eppendorf dalam
berbagai ukuran, dan peralatan gelas.
Tahapan Penelitian
1. Isolasi, seleksi dan identifikasi bakteri penghasil xilanase
2. Formulasi media kultivasi produksi xilanase dengan media bersubstrat oat spelt
xylane.
3. Ekstraksi xilan dari tongkol jagung
4. Formulasi media kultivasi produksi xilanase dengan media bersubstrat xilan dari
tongkol jagung. 5.
Optimasi proses untuk kultivasi isolat bakteri alkalofilik lokal penghasil xilanase unggul pada media bersubstrat xilan dari tongkol jagung.
6. Penentuan reologi cairan kultivasi dan tenaga untuk penggerak impeller
7. Pengendapan, karakterisasi dan pemurnian xilanase
8. Perhitungan finansial industri xilanase
Metode Penelitian Isolasi, Seleksi Dan Identifikasi Bakteri Penghasil Xilanase
Seleksi bakteri dilakukan dengan mengambil contoh tanah dari pembuangan limbah tapioka ‘Setia’ Kedunghalang Bogor, daerah berkapur Purworejo dan Boyolali
Jawa Tengah, dan tanah berkapur Ciampea Bogor Jawa Barat. Tanah diambil secara aseptik dan dimasukkan ke dalam kantong plastik steril dan disimpan sampai siap
digunakan. Isolasi bakteri dari contoh tanah dilakukan dengan mengacu pada penelitian
Nakamura et al 1993 yaitu komposisi media cair untuk satu liter adalah 0,1 g ekstrak khamir, 0,5 g polipepton, 0,1 g K
2
HPO
4
, 0,02 g MgSO
4
7H
2
O dan 0,1 g oat spelt xylan
Sigma. Media diatur pada pH 9,5 dengan penambahan Na
2
CO
3
1. Konsentrasi inokulan yang digunakan sebanyak 10. Inkubasi dilakukan pada
agitasi 150 rpm suhu 30 - 38 C selama 3 hari. Seleksi dilakukan secara bertahap
berdasarkan zona bening yang dihasilkan disekeliling koloni pada media padat di petridish yang bersifat alkali. Tahapan ini merupakan langkah awal untuk mengetahui
apakah isolat tersebut dapat mendegradasi substrat xilan pada media pertumbuhannya. Apabila mampu mendegradasi dengan terbentuknya zona bening
disekeliling koloni maka isolat dinyatakan menghasilkan xilanase. Pada tahap ini seleksi untuk masing- masing isolat dilakukan ulangan sebanyak tiga kali.
Pengujian selanjutnya dilakukan dengan cara menumbuhkan koloni bakteri dari masing- masing isolat pada media cair. Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui
seberapa jauh kemampuan isolat bakteri dalam menghasilkan xilanase. Media cair dengan komposisi sama dengan media untuk isolasi, sebanyak 50 ml dalam
erlemeyer. Setelah pemanenan, dilakukan beberapa pengamatan, yaitu biomasa, protein terlarut dan aktivitas xilanase.
Analisis statistik yang digunakan pada tahap ini adalah rancangan acak lengkap dengan perlakuan 5 isolat bakteri dan C. acetobutylicum ATCC 769 sebagai
kontrol dengan 4 kali ulangan. Dari percobaan ini diambil satu isolat unggul.
Tanah
Isolasi pada media yang diperkaya
Koloni berzona bening
Pembiakan pada media cair NB 5 ml
Propagasi pada media cair media untuk xilanase 50 ml
Seleksi : •
Biomasa •
Protein terlarut •
Aktivitas xilanase
Isolat terpilih
Seleksi tahap II menggunakan isolat C. acetobutylicum ATCC 769
sebagai kontrol
Isolat potensial
Identifikasi Isolat potensial
teridentifikasi
Gambar 3 Diagram alir tahapan kerja isolasi dan seleksi isolat bakteri unggul penghasil xilanase.
Parameter yang diukur yaitu biomassa dengan mengukur kerapatan optik pada panjang gelombang 660 nm menggunakan spektrofotometer. Protein terlarut diukur
dengan metode Bradford 1976. Aktivitas xilanase diukur dengan uji kemampuan enzim menghidrolisis xilan menjadi gula reduksi menurut Winterhalter and Liebl
1995. Analisis gula reduksi dilakukan dengan pereaksi DNS 3,5 asam dinitro salisilat dan berdasarkan serapannya pada panjang gelombang 550 nm. Sebagai
standar digunakan deret larutan standar xilosa. Satu unit aktivitas xilanase adalah jumlah enzim yang dapat menghasilkan gula reduksi xilosa sebanyak 1
µ molmenit
Kubata et al., 1992.
Identifikasi Bakteri Unggul Penghasil Xilanase
Identifikasi dilakukan untuk isolat unggul penghasil xilanase. Pencirian isolat berdasarkan sifat fisiologi, yaitu morfologi koloni dan pewarnaan Gram. Kemudian
uji biokimia meliputi uji katalase, uji Voges-Proskaeur VP dan methyl red MR, uji urease, nitrat dan kemampuan memecah pati. Selanjutnya berdasarkan hasil uji
terhadap mikroorganisme tersebut dapat diketahui spesies mikroorganisme dengan menggunakan metode Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, dalam
Buchanan dan Gibbons 1984. Untuk mendukung hasil identifikasi menggunakan medium sintetik maka dilakukan identifikasi berdasarkan pada sekuen 16S ribosomal
RNA.
Formulasi Media Kultivasi Produksi Xilanase Dengan Media Bersubstrat Oat
Spelt Xylan.
Formulasi media dilakukan dengan cara meragamkan komposisi media untuk pertumbuhan bakteri penghasil xilanase. Rancangan penelitian yang dilakukan yaitu
Rancangan Acak Faktorial dengan tiga faktorial. Ulangan dilakukan tiga kali. Sebagai faktor I adalah oat spelt xylan 0,5; 0,75; 1,0. Faktor II adalah pepton 0;
0,1; 0,3; 0,5, dan faktor III perlakuan ekstrak khamir 0,1; 0,2; 0,3. Kultivasi dilakukan di dalam labu erlemeyer 100 ml menggunakan konsentrasi inokulum 10.
Isolat bakteri terpilih diuji kemampuannya menghidrolisis oat spelt xylan tersebut, dengan mengukur aktivitas xilanase dan kandungan protein terlarut. Contoh
dipanen sesudah 3 hari inkubasi, kemudian diukur protein terlarut dengan metode Bradford 1976 dan aktivitas enzim xilanase menurut Winterhalter dan Liebl 1995.
Ekstraksi Xilan Dari Tongkol Jagung
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu tahap awal adalah analisis proksimat bahan baku meliputi kadar air, abu dan serat AOAC, 1984. Tahap
selanjutnya adalah ekstraksi xilan mengacu pada metode dari Yoshida et al.1994 tentang ekstrak xilan dari biji kapas, kemudian dimodifikasi Gambar 4. Modifikasi
metode dengan menentukan konsentrasi NaOCl pada proses delignifikasi dan perbandingan supernatan dan etanol vv yang tepat untuk ekstraksi xilan,
selanjutnya uji kelarutan, uji kualitatif dan kuantitatif xilan yang diperoleh dari ekstraksi tersebut.
Tongkol jagung kering digiling sampai lolos saringan ukuran 40 mesh. Contoh sebanyak 50 g dimasukkan ke dalam wadah plastik kemudian direndam dalam
larutan NaOCI dengan konsentrasi 0,5; 1; 2,5; 5 dan 7,5 selama 5 jam pada suhu 28
o
C proses delignifikasi. Setelah 5 jam contoh dibilas dengan air dan disaring. Selanjutnya padatan yang dihasilkan direndam dalam larutan NaOH 10 selama 24
jam pada suhu 28
o
C. Perendaman ini bertujuan untuk mengekstraksi xilan. Setelah 24 jam, dilakukan penyaringan. Filtrat yang dihasilkan ditampung untuk diukur pH-
nya dan selanjutnya dinetralkan dengan menggunakan HCI 6N, selanjutnya disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan putaran 4000 rpm. Supernatan yang
dihasilkan dari sentrifugasi mengandung xilan. Xilan yang larut dalam air dapat dipisahkan dengan menambahkan etanol
95. Etanol ditambahkan pada supernatan dengan perbandingan supernatan-etanol adalah 1:1, 1:2, 1:3 dan 1:4. Perbandingan ini dimaksudkan untuk mengetahui pada
rasio berapa jumlah xilan dapat dihasilkan secara optimal. Diagram alir ekstraksi xilan dari tongkol jagung disajikan pada Gambar 4. Rancangan percobaan yang digunakan
dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial 5x4 dengan dua kali ulangan. Pengamatan yang dilakukan adalah rendemen xilan.
Kelarutan xilan diuji dengan melarutkan xilan dalam pelarut alkali NaOH 1, HCl 1N, etanol, air panas dan air dingin. Kelarutan suatu senyawa menunjukkan
seberapa jauh senyawa tersebut dapat larut dalam suatu pelarut. Analisis kualitatif dan kuantitatif xilan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi KCKT dengan
mengukur retention time. Instrumen yang digunakan yaitu KCKT Shimadzu C-R3A, jenis kolom C18, fase gerak air, detektor refraktif indeks dengan kecepatan alir 0,8
mlmenit.
Tepung Tongkol Jagung Perendaman dalam NaOCl
5 jam, suhu 28
o
C
Pencucian Sentrifugasi
4000 rpm, 30 menit
Pengeringan suhu 35
o
C, 24 jam Perendam di NaOH 10
suhu 28
o
C, 24 jam
Sentrifugasi 4000 rpm, 30 menit
Lignin
Endapan Supernatan
Penetralan dengan HCl 6N
Sentrifugasi 4000 rpm, 30 menit
Endapan Supernatan
Etanol 95 Sentrifugasi
4000 rpm, 30 menit Xilan
Keterangan : Metode mengacu pada Yoshida, et al. 1994 yang dimodifikasi pada penambahan konsentrasi NaOCl dan etanol.
Gambar 4 Diagram alir ektraksi xilan dari tongkol jagung
Supernatan
Formulasi media kultivasi produksi xilanase de ngan media bersubstrat xilan dari tongkol jagung.
Formulasi media untuk pertumbuhan RXAIII-5 dibuat dengan memanfaatkan hasil ekstraksi xilan dari tongkol jagung sebagai sumber karbon. Disamping itu juga
dikaji pengaruh pepton dan ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen, dan K
2
HPO
4
sebagai sumber mineral. Kultivasi dilakukan di dalam labu erlemeyer 100 ml menggunakan konsentrasi inokulan 10.
Komposisi media pertumbuhan bakteri sama dengan tahapan sebelumnya dengan beberapa perlakuan konsentrasi xilan tongkol jagung, pepton, ekstrak khamir
dan K
2
HPO
4
. Matrik perlakuan disajikan pada Lampiran 10. Contoh dipanen sesudah 3 hari inkubasi, kemudian diukur biomassanya dengan pengukuran kerapatan optik
pada panjang gelombang 660 nm, protein terlarut diukur dengan metode Bradford 1976 dan aktivitas enzim xilanase menurut Winterhalter dan Liebl 1995.
Rancangan untuk formulasi media dilakukan dengan Respon Surface Methodology
. Empat variabel yang akan dioptimasi ialah polipepton X1, ekstrak khamir X2, xilan X3, dan mineral X4. Matrik perlakuan disajikan pada Lampiran
10. Y
1
= b + b
1
X ii + b
2
X 2i + b
3
X 3i + b
4
X 4i + b
11
X 1i
2
+ b
22
X 2i + b
33
X 3i
2
+ b
44
X 4i
2
+ b
12
X 1i X 2i + b
13
X 1i X 3i + b
14
X 1i X 4i + b
23
X2i X 3i + b
24
X 2i X 3i + b
34
X 3i X 4i + ri
Optimasi Kondisi Proses
Kondisi optimum proses meliputi pH dan suhu dilakukan pada skala 50 ml kemudian dilanjutkan aerasi dan agitasi pada bioreaktor 2l.
1. Penentuan optimasi proses pH dan suhu. Kajian pengaruh pH dan suhu terhadap laju pertumbuhan bakteri RXAIII-5.
Interval untuk suhu X1 35 - 55 C sedangkan pH X2 7 - 11, dan kecepatan
shaker X3100 sampai 140 rpm. Kultivasi dilakukan di dalam labu erlemeyer 100 ml menggunakan konsentrasi
inokulan 10. Komposisi media pertumbuhan bakteri berdasarkan hasil tahapan formulasi media bersubstrat xilan tongkol jagung.
Rancangan percobaan untuk optimasi kondisi kultivasi dilakukan dengan Respon Surface Metodology
RSM Box-Behnker dengan 3 variabel. Matrik
perlakuan disajikan pada Lampiran 11. Pengamatan dilakukan terhadap biomassa, aktivitas xilanase, kandungan protein terlarut dan substrat tersisa.
2. Optimasi proses untuk aerasi dan agitasi Kajian optimasi proses untuk aerasi dan agitasi dilakukan dengan memproduksi
enzim xilanase dalam bioreaktor. Media yang digunakan sebanyak satu liter dilakukan pada pH dan suhu hasil optimasi 50 ml. Pada penelitian tahap ini
kecepatan agitasi dilakukan pada 100, 150 dan 200 rpm. Laju aerasi dilakukan pada 0.5 dan 1.0 vvm volume udara per volume media per menit. Proses
dijalankan secara terkendali dengan penambahan NaOH maupun HCl untuk pengatur pH dan silicone antifoaming agent sebagai antibuih yang
penambahannya dilakukan secara automatik. Pemanenan hasil kultivasi dilakukan pada jam ke-0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 36, 40, 44, dan 48. Hasil panen
disentrifus kecepatan 4000 rpm untuk memisahkan massa sel dengan supernatan yang akan dianalisis. Pengamatan meliputi biomassa, aktivitas enzim dan
kandungan protein terlarut.
Kinetika Kultivasi Dalam Bioreaktor Biostat-B-2l
Kombinasi laju aerasi dan kecepatan agitasi tersebut digunakan dalam
perhitungan parameter kinetika. Pada tahap ini akan dikembangkan model matematika
untuk menjelaskan dinamika sistem yang meliputi perubahan sel, substrat, produk selama kultivasi. Model yang digunakan adalah model yang dikembangkan oleh
Monod 1949.Kerangka model matematika adalah sebagai berikut: dxdt = µ x untuk biomasa
µ = µ
maks
.SK
s
+ S atau 1µ = K
s
µ
maks
1S +1µ
maks
Y
ps
= -dPdS efisiensi penggunaan substrat untuk membentuk produk ensim Y
px
= dPdX efisiensi sel dalam menghasilkan produk Yxs = -dXdS efisiensi penggunaan substrat untuk produksi sel
X : Konsentrasi sel gL, S : Konsentrasi substrat gL
P : Konsentrasi produk t : Waktu kultivasi jam
µ: laju pertumbuhan spesifik ljam k
s
: konstanta gL µ
maks
: laju pertumbuhan spesifik maksimum ljam
Parameter kinetik yang meliputi µ
maks
, Y
ps
, Y
xs,
Y
px
ditentukan dari data percobaan menggunakan teknik regresi linear, yaitu µ
maks
merupakan kemiringan kurva dari hubungan ln bobot kering dan waktu, Y
ps,
Y
xs,
dan Y
px
berturut-turut merupakan kemiringan kurva dari hubungan perubahan produk enzim dan substrat, biomassa
dan substrat serta produk dan biomasa.
Sifat Reologi Cairan Kultivasi
Penentuan densitas cairan kultivasi dilakukan dengan alat piknometer, yaitu pembagian bobot cairan kultivasi dengan volumenya. Viskositas dihitung dengan alat
Brookfield Viscometer pada kecepatan putar 6,12, 30, 60 rpm menggunakan spindle
nomor 2. Dari data tersebut diperoleh laju geser, viskositas dan tegangan geser, sehingga diperoleh nilai k= Indeks konsistensi dan nilai n= Indeks perilaku cairan.
Bilangan Reynolds NRe ditentukan dengan persamaan NRe = N
1
D
1 2
? µ
a
Dimana : N
1
: kecepatan pengadukan, D
1
: Diameter pengaduk, ?: Densitas , µ
a
: Viskositas, k : Indeks konsistensi, n : Indeks perilaku cairan Berdasarkan data tersebut dan data dari bioreaktor Model Biostat-2l, maka dapat
ditentukan konsumsi tenaga impeller. Menurut Wang et al 1979 konsumsi tenaga yang dibutuhkan ditentukan dengan persamaan:
P = ? N
3
D
1 5
Np g
c
Dimana: P = tenaga yang dibutuhkan, Np = Bilangan power, g
c
= Grafitasi = 9,81 cmdet
2
. Dasar-dasar untuk penggandaan skala ditentukan berdasarkan tenaga per unit volume.
Karakterisasi Enzim Xilanase Dari Isolat Bakteri Terpilih
Sebelum karakterisasi xilanase dilakukan pengendapan terlebih dahulu. Hasil pengendapan yaitu enzim kasar dilakukan karakterisasi meliputi stabilitas xilanase
pada pH dan suhu optimum, Km dan Vmaks, inhibisi dan aktivasi enzim. Disamping itu terhadap hasil pengendapan yang beraktivitas xilanase tertinggi dilakukan
pemurnian.
Pengendapan Enzim
Produksi xilanase dari isolat bakteri terpilih dilakukan pada media cair dengan komposisi berdasarkan hasil tahapan sebelumnya. Fermentasi dihentikan setelah 48
jam dan dilanjutkan dengan pemisahan biomasa bakteri dari cairan kultivasi broth. Semua tahapan dilakukan pada kondisi suhu 4
o
C. Supernatan 100 ml hasil kultivasi yang telah dipisahkan dari biomasa,
kemudian diendapkan. Perlakuan pengendapan menggunakan: 1 Amonium sulfat 80 jenuh, 2. Aseton dan 3. Etanol -20
o
C dengan perbandingan 1:2. lalu disentrifugasi 4000 rpm selama 15 menit. Diagram alir perlakuan disajikan pada
Gambar 5.
Pemurnian enzim
Pemurnian enzim dilakukan pada enzim kasar dari hasil pengendapan dengan amonium sulfat. Endapan didialisis menggunakan bufer fosfat 50 mM, pada pH 7
selama 15 jam Lin et al. 1999. Hasil dialisis dimurnikan menggunakan alat preparative electrophoresis
Prepcell 491 Biorad. Pemurnian ini berdasarkan
Produksi enzim 1500 ml pada kondisi optimum
Sentrifugasi 4000 rpm 30 menit 4
o
C
Supernatan Endapan
biomasa
Presipitasi penamb ahan amonium
sulfat
Enzim kasar
Gambar 5 Diagram alir pengendapan enzim xilanase.
Presipitasi penambahan etanol
Presipitasi penambahan aseton
Sentrifugasi 4000 rpm, 30 menit 4
o
C
elektroforesis. Native-PAGE non SDS_PAGE digunakan untuk menghilangkan protein kontaminan. Pemurnian dalam gel dengan alat ini memerlukan waktu 8 jam,
dengan arus sebesar 40 mA 12 watt constant power. Hasil pemurnian berupa fraksi xilanase dikumpulkan dengan fraction collector.
Setiap fraksi diuji aktivitas enzimnya didasarkan pada kemampuan xilanase pada fraksi tersebut dalam menghidrolisis xilan.
Pene ntuan Aktivitas dan Stabilitas Enzim Pada pH Dan Suhu Optimum
Penentuan aktivitas dan stabilitas xilanase pada pH dan suhu optimum dilakukan menurut Ratakhanokchai et al. 1999. Penentuan aktivitas pada pH
optimum dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim kasar pada berbagai kondisi pH. Kondisi pH katalitik optimum didapat dengan melarutkan enzim dalam bufer
fosfat-sitrat pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 dan 9,0, dengan masa inkubasi 30 menit dan suhu 50
o
C. Pengenceran juga dilakukan dengan bufer pH yang sama. Untuk mengetahui pengaruh pH terhadap stabilitas xilanase, enzim tersebut diinkubasi pada
bufer pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 dan 9,0 dengan suhu 4
o
C selama 0, 18, dan 24 jam. Penentuan aktivitas pada suhu reaksi optimum, dilakukan dengan mengukur
aktivitas enzim pada berbagai suhu reaksi, yaitu 30
o
C, 40
o
C, 50
o
C, 60
o
C, dan 70
o
C dengan masa inkubasi 30 menit dan pH reaksi 7,0. Sedangkan pengaruh suhu terhadap
stabilitas xilanase diuji dengan menginkubasi enzim pada suhu 40
o
C, 50
o
C, 60
o
C, dan 70
o
C selama 5, 10, dan 15 menit. Aktivitas sisa xilanase diukur dengan metode standar.
Penentuan K
m
dan V
maks
Nilai V
maks
dan K
m
dari xilanase diperoleh dari uji hidrolisis dengan substrat xilan pada interval konsentrasi 0 - 2 bv. Xilosa yang terbentuk diukur dengan
metode pengukuran aktivitas standar. Penentuan nilai V
maks
dan K
m
ini dilakukan terhadap enzim kasar berdasarkan grafik Lineweaver-Burk Tucker and Wood.
1995.
Pengaruh Inhibitor dan Aktivator
Pengaruh logam terhadap aktivitas enzim dilakukan dengan menginkubasi cairan enzim kasar dengan ion logam dan senyawa lain pada konsentrasi akhir 0,1 -
10 mM. Ion logam berat yang dicobakan adalah Co
2+
, Cu
2+
, Fe
3+
, Mn
2+
, Ag
2+
, dan ion Zn
2+
, Mg
2+
,Ca
2+
, Na
+
, pada konsentrasi 2,0 mM, 4,0 mM dan 10,0 mM dalam persenyawaan garamnya. Sedangkan untuk EDTA konsentrasinya ditetapkan 0,1
mM, 0,2 mM, dan 0,5 mM. Pada penelitian juga diperiksa pengaruh hasil hidrolisis oleh enzim yang berupa gula-gula reduksi. Senyawa yang dimaksud adalah glukosa,
maltosa dan sukrosa yang ditetapkan konsentrasinya sebesar 2 mM, 4mM, dan 10 mM.
Inkubasi dilakukan selama 30 menit pada suhu 50
o
C dan aktivitas enzim diukur dalam kondisi standar. Tingkat inhibisiaktivasi relatif ditentukan dengan
perbandingan dalam persen antara aktivitasnya dengan inhibitoraktivator terhadap aktivitas enzim tanpa inhibitoraktivator.
Kemampuan Enzim Xilanase Untuk Mendegradasi Xilan
Untuk mengetahui kemampuan xilanase mendegradasi xilan, maka xilan dari tongkol jagung sebanyak 1g dalam 5 ml bufer fosfat pH 9 ditambah cairan enzim
kasar 1ml kemudian diinkubasi pada suhu 50
o
C selama 16 jam Kulkarni et al. 1995. Hasil hidrolisis diukur menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
KCKT Shimadzu C-R3A dengan jenis kolom C 18, fase gerak air, detektor refraktif indeks RI dengan kecepatan alir 1 mlmenit.
Kemampuan enzim kasar mendegradasi substrat spesifik
Untuk mengetahui kemampuan enzim kasar mendegradasi beberapa substrat spesifik dilakukan dengan menginkubasi enzim kasar dengan substratnya yaitu oat
spelt xylan, xilan tongkol jagung, carboxymethyl cellulose CMC dan avicel.
Sebanyak 1 ml enzim kasar ditambahkan 5 ml larutan substrat 1 g diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37
o
C pH 9 Dung et al. 1993.
39
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Xilanase
Pengujian isolasi bakteri menghasilkan 25 koloni yang mampu tumbuh pada media xilan dan dapat menghasilkan zona bening, dengan diameter lebih dari tiga
millimeter. Koloni yang kurang dari 3 mm, walaupun berzona bening tidak digunakan Gambar 6. Zona bening terbentuk karena adanya aktivitas hidrolisis xilan oleh enzim
xilanase. Data pertumbuhan sel, protein terlarut, aktivitas xilanase dan aktivitas spesifik disajikan pada Tabel 4, dan data selengkapnya disajikan pada Lampiran 4.
A: Koloni berdiameter kurang dari 3 mm tidak digunakan B: Koloni berdiameter lebih dari 3 mm digunakan untuk uji selanjutnya
Gambar 6 Penampakan koloni bakteri penghasil xilanase. Dalam penelitian ini isolasi bakteri berasal dari tanah tempat pembuangan limbah
tapioka onggok dengan pH asam dan tanah berkapur dengan pH lebih besar atau sama dengan 7. Maksud penggunaan tanah berkapur dengan pH tinggi, agar diperoleh isolat
yang mampu tumbuh pada media ber pH 7 atau lebih. Pada umumnya isolat bakteri yang dihasilkan mempunyai kemampuan tumbuh tidak jauh dari habitatnya. Seperti halnya
hasil penelitian Saha 2002, isolasi mikroba penghasil xilanase yang berasal dari limbah jagung silase dengan pH kurang dari 7 menghasilkan xilanase yang stabil pada pH 5-
7,5.
A
B
40
Tabel 4 Kepekatan optik, kandungan protein, aktivitas enzim dan aktivitas spesifik dari beberapa isolat bakteri penghasil xilanase
No .
Isolat bakteri
Kepekatan optik
Protein mgml
Aktivitas enzim Uml
Aktivitas spesifik Umg protein
1. RXON-1 0,981+0,127
0,231+0,007 0,051+0104
0,464+0,065 2.
RXON-2 0,931+0,089 0,198+0,014
4,468+0,394 22,552+0,381
3. RXON-3 1,021+0,277
0,187+0,011 5,546+0,241
29,751+3,087
4. RXON-4 0,897+0,013
0,234+0,017 5,546+0,578
23,853+4,200
5. RXON-5 0,931+0,156
0,219+0,003 0,198+0,013
0,907+0,072 6.
RXA-I1 0,288+0,098
0,311+0,004 2,917+0,662
9,385+1,024 7.
RXA-I2 0,402+0,092
0,311+0,005 0,734+0,662
2,347+1,095 8.
RXA-I3 0,397+0,096
0,332+0,004 2,449+0,882
7,363+0,256 9.
RXA-I4 0,664+0,123
0,290+0,002 1,670+0,662
5,741+0,226 10. RXA-I5
0,376+0,051 0,338+0,001
12,430 +0,882
36,719 +2,529
11. RXA-I6 0,329+0,045
0,298+0,003 1,826+0,882
8,105+1,883 12. RXA-I7
0,502+0,156 0,301+0,007
3,697+0,882 12,363+1,232
13. RXA-I8 0,589+0,129
0,302+0,002 2,449+0,882
8,105+1,883 14. RXA-I9
0,337+0,040 0,281+0,001
2,761+0,441 9,825+0,520
15. RXA-II1 0,528+0,117
0,297+0,002 1,826+0,882
6,141+0,941 16. RXA-II4
0,654+0,158 0,264+0,005
2,761+0,441 10,467+1,477
17. RXA-II5 1,249
+0,198 0,289+0,001
3,385+0,323 11,729+1,558
18. RXA-III1 1,013+0,198 0,332+0,001
